[发明专利]识别肠癌血清标记物的核酸适配体及其筛选方法和用途

权利要求书

1.一种识别肠癌血清标记物的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列包括以下Seq1-Seq4中任意一种所示的DNA片段：

Seq-1：

5'-CTATAGCAATGGTACGGTACTTCCCCTTGTCGATTCATAATGTTCGTGGAACTCGCTCTCGGGACAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3'

Seq-2：

5'-CTATAGCAATGGTACGGTACTTCCTAACTCGTCCCTACCGAGCCTCTCTCTGGTCCTTGCAACTCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3'

Seq-3：

5'-CTATAGCAATGGTACGGTACTTCCTAGTTGAGCATTATACACATTGACTGGGCTGTTCTTCTGTCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3'

Seq-4：

5'-CTATAGCAATGGTACGGTACTTCCTGCTGGTTCGGCATGGCTTGCGACTGTCCCTGCGCATTTCCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3'。

2.根据权利要求1所述的识别肠癌血清标记物的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置通过磷酸骨架修饰、截断、延长、颠换、或对碱基进行化学修饰。

3.根据权利要求1所述的识别肠癌血清标记物的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列上结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料或酶标记。

4.根据权利要求1～3任一项所述的识别肠癌血清标记物的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体还包括以下三种序列中的任意一种：

(1)与所述识别肠癌血清标记物的核酸适配体的核苷酸序列的同源性在80％以上；

(2)与所述识别肠癌血清标记物的核酸适配体的核苷酸序列进行杂交的序列；

(3)与所述识别肠癌血清标记物的核酸适配体的核苷酸序列转录的RNA序列。

5.根据权利要求1～4任一项所述的识别肠癌血清标记物的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的检测引物序列为：

上游引物：P6：5'-CTATAGCAATGGTACGGTACTTCC-3'

下游引物：P9：5'-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3'。

6.根据权利要求5所述的识别肠癌血清标记物的核酸适配体，其特征在于，在所述核酸适配体的检测下游引物P9的5'标记有生物素。

7.一种如权利要求1～6任一项所述的识别肠癌血清标记物的核酸适配体的筛选方法，其特征在于，所述核酸适配体的筛选步骤为：

(1)第1轮正筛：使用随机文库ssDNA与磁珠-肠癌血清蛋白复合物孵育，经过洗脱重悬，得到第1轮正筛模板；

(2)PCR检测：将步骤(1)得到的正筛模板加入到PCR扩增体系中进行扩增，记录Ct值；

(3)第2轮次级库制备：对步骤(1)得到的正筛模板进行PCR扩增，经过单链制备获得第2轮使用的次级文库；

(4)第2轮反筛：使用步骤(3)得到的次级文库与磁珠-健康人血清蛋白复合物孵育，得到第2轮正筛文库，通过洗脱磁珠-血清复合物，得到第2轮反筛模板；

(5)第2轮正筛：使用步骤(4)得到的正筛文库与磁珠-肠癌血清蛋白复合物孵育、洗脱得到第2轮正筛模板ssDNA；

(6)PCR检测：将反筛模板和正筛模板加入到PCR扩增体系中进行扩增，记录Ct值；

(7)重复步骤(3)～(6)，分别收集多轮结合到磁珠-肠癌血清复合物和磁珠-健康人血清复合物上的ssDNA，检测得到多轮的回收率和正、反筛的Ct值，至第10轮时检测出阳性的Ct值小于阴性的Ct值且ΔCt＝3-4，且电泳检测没有杂带说明筛选成功；

(8)高通量测序及序列分析：将富集筛选出的第10轮次级ssDNA文库的PCR扩增产物进行高通量测序。