[发明专利]一种MGO-漆酶的制备方法

说明书

本发明公开了一种MGO‑漆酶的制备方法。通过改进的Hummers法制备氧化石墨烯，再采用共沉淀的技术将四氧化三铁沉积到氧化石墨烯上，获得磁性氧化石墨烯。将来自枯草芽孢杆菌cjp3的CotA漆酶通过与EDC/NHS共价键合的方式固定在磁性氧化石墨烯上。EDC/NHS作为交联剂方便快捷，无需对载体材料氨基功能化，减少了固定化成本和时间，易于实现工业化生产。同时MGO‑漆酶的负载范围大，固定能力强，具有更宽的pH和温度适用性。将MGO‑漆酶应用于孔雀石绿染料的脱色，脱色率高达98.5％，重复使用性高，毒性明显降低，是一种有前景的复合生物催化剂。

技术领域

本发明涉及酶的固定化领域，具体涉及一种MGO-漆酶的制备方法。

背景技术

漆酶是多铜氧化酶蛋白家族的成员之一，分布在真菌、细菌和植物中。漆酶由于具有宽的作用底物范围和优良的催化效率，已广泛用于纺织、造纸及印染等工业中染料和纸浆的脱色。然而，难以将水溶性漆酶从反应体系中分离出来，阻碍了其再次利用。此外，漆酶活性难以在恶劣的操作环境下维持，包括高温，宽pH范围和有机溶剂存在，这些考虑因素都抑制了漆酶的工业应用。

为了克服上述漆酶使用的缺点，酶的固定被认为是改善其活性，稳定性，可重复性和可分离性质的有前途的新策略。最近，氧化石墨烯(GO)已被开发成为酶合适的载体。同时由于磁性氧化石墨烯(MGO)纳米载体材料本身既具有磁性材料的磁响应和粒子表面积大、粒径小的特点，也具有氧化石墨烯的大的表面积，良好的生物相容性和无毒性的优点，给漆酶的固定化带来了很大优势。

中国发明专利申请文件CN 106636056 A公开了一种氨基硅烷化磁性氧化石墨烯纳米粒子共固定化漆酶和介体系统及其制备方法，将漆酶和介体共同固定化在氨基硅烷化磁性氧化石墨烯纳米粒子上。上述方法中需要对载体磁性氧化石墨烯进行复杂的氨基硅烷化修饰，再以戊二醛作为交联剂共固定漆酶和介体系统，戊二醛本身具有环境低毒性，且漆酶和介体同时被固定在材料上有助于回收酶和介体，但同时会影响酶和介体接触的可及性。因此环保简便快捷地制备出性能稳定的MGO-漆酶具有十分重要的意义。

发明内容

发明目的：针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种MGO-漆酶的制备方法，通过使用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)构建具有磁性氧化石墨烯(GO)和来自枯草芽孢杆菌的CotA漆酶的复合系统(MGO-漆酶)，EDC/NHS将激活GO表面的-COOH并促进固定化漆酶的稳定性。EDC/NHS作为交联剂方便快捷，无需对载体材料氨基功能化，减少了固定化成本和时间，易于实现工业化生产。另外，掺杂磁性纳米颗粒，可以在外界磁场作用下轻易快速的从反应体系中分离出MGO-漆酶，为建立简便的固定化方法提供了技术基础。制得的MGO-漆酶的负载范围大，固定能力强，具有更宽的pH和温度适用性。将MGO-漆酶应用于孔雀石绿染料的脱色，脱色率高达98.5％，重复使用性高，毒性明显降低，是一种有前景的复合生物催化剂。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种MGO-漆酶的制备方法，包括以下步骤：

1)通过改进的Hummers方法制备氧化石墨烯；

2)通过共沉淀技术制备磁性氧化石墨烯；

3)将磁性氧化石墨烯、漆酶溶液分散在柠檬酸磷酸盐缓冲液中，然后加入EDC和NHS，混合物150rpm振荡温育，共价交联，磁分离，得到MGO-漆酶；其中，柠檬酸盐磷酸盐缓冲液的pH值为3～8，固定温度为5～55℃，温育时间为0.5～12h，漆酶溶液初始浓度为40～150μg/mL。

步骤3)中磁性氧化石墨烯、漆酶溶液、EDC和NHS的质量体积比为2mg∶lmL∶2mg∶2mg。

步骤3)柠檬酸盐磷酸盐缓冲液的pH值为7，固定温度为25℃，温育时间为4h，漆酶溶液初始浓度为92.97μg/mL。