[发明专利]一种Rochel反转录试剂及其制备方法

说明书

本发明公开了一种Rochel反转录试剂及其制备方法，具体涉及细胞生物科技领域，包括去离子水、EASY Dilution for Real Time PCR、gDNA Eraser、5x gDNA Eraser Buffer、RNase抑制剂和基因引物，所述基因引物包括端粒酶反转录酶、酸甘油醛脱氢酶、碱性磷酸酶、核心结合因子、骨涎蛋白、骨钙素、骨桥素和Ⅰ型胶原蛋白。本发明通过设有多种组合基因引物，便于骨质细胞繁殖，应用过程中反转录速度快，且成活率高，生长率好，有利于牙周膜再生治疗研究，生产过程中无菌处理，并采用低温储存，反转录试剂质量好，储备时间长，能够满足DNA生物合成需要。

技术领域

本发明涉及细胞生物科技领域，更具体地说，本发明涉及一种Rochel反转录试剂及其制备方法。

背景技术

牙周膜是连接牙骨质和牙槽骨的结缔组织，牙周膜细胞(periodontal ligamentcells，PDLCs)中有多种细胞群体，主要有成纤维细胞，成牙骨质细胞，造骨细胞，内皮细胞，Malaseez上皮细胞，破骨细胞等。近年来的研究发现PDLCs有类似间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)功能的细胞，能在体外分化为成骨细胞，脂肪细胞及神经样细胞，使牙周组织的再生成为可能,遗憾的是牙周膜的再生机制尚不明晰。牙周膜的再生研究方面,主要受限于原代PDLCs的传代培养会降低细胞的分化潜能，并失去原代特性,比如,不同代数牙周膜的成骨分化能力差异非常大。所以建立与原代PDLCs表型和生长特性相同,并能稳定传代的PDLCs细胞系，对牙周膜再生机制的研究提供细胞平台,有着重大的意义。

构建保留原代细胞特征的稳定的人PDLCs细胞系存在诸多难点。Kamata等人通过共转染hTERT和人乳头状瘤细胞病毒16成功构建了人PDLCs系，可是这些细胞失去了钙化潜能。通过导入各种抑癌基因以期构建稳定的细胞系时，细胞的形态，生长状态都可能发生改变。而人端粒反转转录酶(Human telomerase reverse transcriptase,hTERT)是细胞内正常基因，诱导端粒长度伸长并延伸体细胞的复制寿命，相对于传统的永生化基因，端粒酶转染建立的细胞系是正常细胞而非转化细胞，具有正常的核型和生长速度。

通过慢病毒过表达hTERT可以构建PDLCs细胞系，但hTERT基因片段大，重组病毒的滴度不高，表达hTERT效率低，效果不理想。而重组腺病毒是比较高效和可靠的重组病毒表达系统之一，其病毒滴度高，可以更有效地介导hTERT的表达。

因此，发明一种Rochel反转录试剂及其制备方法来表达hTERT，对研究牙周膜再生治疗方面很有必要。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的实施例提供一种Rochel反转录试剂及其制备方法，通过设有多种组合基因引物，端粒酶反转录酶、酸甘油醛脱氢酶、碱性磷酸酶、核心结合因子、骨涎蛋白、骨钙素、骨桥素和Ⅰ型胶原蛋白，便于骨质细胞繁殖，RNA反转录cDNA错误率低，应用过程中反转录速度快，且成活率高，生长率好，有利于牙周膜再生治疗研究。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种Rochel反转录试剂，其中所使用的主料按重量计包括：去离子水2-3ml、EASY Dilution for Real Time PCR1-2ml、gDNAEraser0.1-0.3ml、5x gDNA Eraser Buffer0.2-0.4ml、RNase抑制剂0.03-0.05ml和基因引物0.3-0.5ml，所述基因引物包括端粒酶反转录酶0.05-0.1ml、酸甘油醛脱氢酶0.05-0.1ml、碱性磷酸酶0.04-0.06ml、核心结合因子0.04-0.06ml、骨涎蛋白0.03-0.05ml、骨钙素0.03-0.05ml、骨桥素0.02-0.04ml和Ⅰ型胶原蛋白0.02-0.04ml。

优选的，所述基因引物中各引物序列具体如下：