[发明专利]一种磷脂酶D突变体及其应用

说明书

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种磷脂酶D突变体及其制备与应用。其技术方案是利用重组DNA技术对野生型磷脂酶D基因进行定点突变，得到活力较高的磷脂酶D基因，然后将高活力磷脂酶D基因在枯草芽孢杆菌表达系统、毕赤酵母表达系统(包括毕赤酵母游离表达系统和毕赤酵母细胞表面展示系统)中表达，得到产高活力磷脂酶D的重组菌株，表达后，检测高活力磷脂酶D的比酶活较野生型磷脂酶D提高38‑140％，高活力磷脂酶D在枯草芽孢杆菌表达系统、毕赤酵母表达系统、毕赤酵母表面展示系统内发酵酶活最高值分别为36.8U/ml、48.1U/ml、140.2U/(g·细胞干重)。

本申请为发明专利申请201610402557.7的分案申请，201610402557.7的申请日为2016年6月2日，申请号为201610402557.7，发明名称为一种新型磷脂酶D及其制备磷脂酸、磷脂酰丝氨酸的方法。

技术领域：

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及通过重叠PCR技术体外定向进化获得比酶活提高的磷脂酶D突变体，并提供由高活力磷脂酶D催化制备磷脂酸和磷脂酰丝氨酸的方法。

背景技术：

磷脂酶D(PLD)分布广泛，存在于各种动植物和微生物中。PLD对磷脂分子中的磷酰氧键P-O起作用，其生物催化作用主要体现在两种反应：(1)水解磷脂上的末端磷酸酯键生成磷脂酸和羟基化合物；(2)当有另一种含羟基的化合物存在时，可催化磷脂酰基与其结合，形成新的磷脂，即磷脂酰基转移反应。

磷脂酸(Phosphatidic acid,PA)是一种简单而又常见的磷脂，广泛存在于动植物细胞中，是动植物细胞生物膜的基本成分。PA由甘油骨架、1或2号位的脂肪酸基团、3号位的磷酸基组成。PA是PLD作用的直接产物，PA能够带动Ca²⁺激活或协同激活细胞内各种酶，与此同时，PA还可促进细胞有丝分裂、促进细胞内超氧化物的形成、引起肌肉的收缩、促进激素分泌、诱发血小板聚集等作用。基于以上作用，PA可应用在食品工业、医药工业、化妆品等方面。

磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)是一类普遍存在的磷脂，通常位于细胞膜内层，是细胞膜的重要组成部分，由于参与一系列膜功能反应，尤其在人体的神经系统中，是大脑细胞膜的重要组分之一，其对改善记忆力、缓解压力、修复大脑损伤、治疗儿童多动症、抑郁症以及预防老年痴呆症等作用效果显著。但具有一定纯度磷脂酰丝氨酸自然界中含量稀少，故制备纯度高、质量好的磷脂酰丝氨酸产品具有重要意义。

酶法制备磷脂酸或磷脂酰丝氨酸是指在一定条件下，用PLD催化底物(如PC)反应生成磷脂酸或磷脂酰丝氨酸，该方法相比化学合成具有反应条件温和、副产物少、产品得率高、质量好等优点。生产磷脂酸或磷脂酰丝氨酸的不同点在于PLD催化反应类型不同，前者属于水解反应，后者则是通过使用PLD的磷脂酰基移转(transphosphatidylation)反应，对磷脂的头基进行修饰。

酶分子体外定向进化属于蛋白质的非理性设计，属于蛋白质工程的范畴。通常手段是利用分子生物学手段在分子水平创造出分子的多样性，结合灵敏、高通量的筛选技术，从而能够在短时间内得到理想的突变体。它不需事先了解蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等因素，而是人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外改造酶基因，获得具有某些预期特征的改构酶，与此不同，需要事先了解蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等因素，并根据这些因素有的放矢做对其DNA进行改造的是定点突变。

定点突变，又称为理性设计，就是在已知的DNA序列中插入、缺失或取代一定长度的核苷酸序列，由于其迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。本发明所使用的重叠PCR技术是定点突变技术的一种，该技术可以简单、快速的将两个或多个基因片段通过末端互补、重叠延伸进行体外基因的拼接。重叠PCR技术可以获得依靠限制性内切酶消化难以得到的产物，并且方便快速，在进行大片段基因的定点突变、基因片段删除以及多个编码序列嵌合连接上具有独有的优势。