[发明专利]OLA和MQCA免疫亲和柱及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及喹噁啉类化合物的检测，具体涉及OLA和MQCA免疫亲和柱及其制备方法与应用。本发明提供的OLA和MQCA免疫亲和柱，包括偶联有OLA单克隆抗体的固相介质和偶联有MQCA单克隆抗体的固相介质；所述固相介质为CNBr活化的Sepharose 4B；它是由CNBr活化的Sepharose 4B经溶胀后分别与OLA和MQCA的mAb偶联，然后对未偶联的活化位点进行封闭后而获得分别偶联有OLA、MQCA单克隆抗体的固相介质。本发明提供一种OLA和MQCA免疫亲和柱，可以对目标物进行高效净化，回收率高、操作简单。

技术领域

本发明涉及喹噁啉类化合物的检测，具体涉及喹乙醇和MQCA免疫亲和柱及其制备方法与应用。

背景技术

民以食为天，食以安为先。随着人民生活水平的提高，人们对食品的安全要求越来越高。喹噁啉类化合物(Quinoxaline,QELs)是一类具有抗菌活性的物质,主要通抑制DNA合成达到抗菌作用，广泛应用于畜禽动物和水生动物疾病的防治，喹乙醇(Olaquindox,OLA)是该类药物的典型代表物质。世界卫生组织和世界粮农组织等已经确定OLA的残留标示物为MQCA(3-甲基喹喔啉-2-羧酸)。目前有关喹噁啉类药物及其代谢物残留检测的仪器分析方法比较多，如气相色谱质谱联用(GC–MS)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱串联质谱联用(LC–MS/MS)。样品前处理主要包括目标物的提取分析和对目标物的分离净化，其中对OLA与MQCA进行有效的富集净化是质谱定量分析的关键。

近年来，在净化步骤，新型材料得到了较为广泛的关注和应用。然而由于动物可食性组织中内源性物质多，常规的液液萃取不能有效排除这些物质的干扰，尤其是在使用LC－MS/MS检测时，这些干扰物质会产生严重的基质效应，干扰检测器、增加基线噪音、降低柱效、阻塞色谱管路、污染色谱柱等。因此使用较多的是固相萃取净化方法。免疫前处理方法中免疫亲和层析(Immunoaffinity Chromatography，IAC)是目前发展较为广泛和成熟的分离手段之一。IAC是以抗原与抗体之间的特异性、可逆性结合反应为基础的亲和色谱，该方法具有其他方式不可比拟的选择性和极高的灵敏度(亲和常数高达10¹⁰-10¹²)，通常只需“加样-洗涤-洗脱”一步层析(one-step system)就可使复杂样品中痕量的特定组分得到高度净化与浓缩，净化后的样品可直接用于GC、HPLC或HPLC-MS/MS分析，同时，IAC柱能方便地获得再生。所以，IAC在食品安全检测中有广泛应用，其优点是回收率高、操作简单、净化效果好等。

发明内容

为实现喹噁啉类化合物及其代谢产物的快速检测，本发明提供一种OLA和MQCA双层串联免疫亲和柱，可以对目标物进行高效净化，回收率高、操作简单。

具体而言，本发明提供一种OLA和MQCA免疫亲和柱，包括位于上部的偶联有OLA单克隆抗体的固相介质和位于下部的偶联有MQCA单克隆抗体的固相介质，二者以筛板隔开；所述固相介质为CNBr活化的Sepharose 4B。

研究发现，相对于直接将偶联有OLA单克隆抗体的固相介质和偶联有MQCA单克隆抗体的固相介质混合装填于柱管中，本发明采用将二者以筛板隔开并且将偶联有OLA单克隆抗体的固相介质置于上部的优点在于同种固相介质的均匀分布可以有效避免空间位阻和竞争反应，保证目标物OLA和MQCA的充分吸附，更有利于对复杂样品基质中痕量或超痕量OLA和MQCA的特异性选择和高亲和分离。

本发明所述上部是指距离免疫亲和柱上样口近的一端，而所述下部是指距离免疫亲和柱洗脱液出口近的一端。

进一步地，免疫亲和柱中装填的所述偶联有OLA单克隆抗体的固相介质和偶联有MQCA单克隆抗体的固相介质的厚度均优选为50mm。其优点在于保证充足的CNBr活化的Sepharose 4B固相介质，偶联足够量的抗体，又不至于过厚而导致过柱堵塞现象。