[发明专利]一种结合透明带削薄的小鼠胚胎抗应激冻存和解冻方法

说明书

本发明公开了一种结合透明带削薄的小鼠胚胎抗应激冻存和解冻方法，属于胚胎保存技术领域。本发明的抗应激冻存方法包括如下步骤：(1)抗应激冷冻液的配置；(2)胚胎透明带的削薄；(3)将削薄的胚胎放入冷冻平衡液中平衡，待胚胎恢复至原体积80％，将其转入到冷冻液中在不同液滴间清洗转移，并控制在1分钟之内将胚胎放入到载杆上，迅速浸入到液氮中。本发明通过对透明带进行削薄，配合抗应激冷冻液的使用，能显著提高胚胎冷冻复苏率，保护冷冻胚胎的发育潜能及降低妊娠后的流产率。

技术领域

本发明涉及胚胎保存技术领域，具体涉及一种结合透明带削薄的小鼠胚胎抗应激冻存和解冻方法。

背景技术

胚胎冷冻保存技术是胚胎移植的关键技术之一，它解决了胚胎移植受时间和地点的限制，使胚胎移植的优越性得以最大发挥。目前小鼠胚胎冷冻主要有慢速冷冻和玻璃化冷冻，但以上两种方法均存在一定缺陷。慢速冷冻体需要昂贵的程序化冷冻仪，且胚胎体外平衡操作时间长，冷冻操作复杂，导致胚胎体外停留时间长，对胚胎产生不良的应激，此外这种方法复苏率在70％-80％，复苏率偏低。玻璃化冷冻采用高浓度的冷冻保护剂，胚胎冷冻时间有所缩短，冷冻复苏率也较高，但存在高浓度冷冻保护剂对胚胎体外操作的毒性和应激损伤。因此，需要进一步改变体外胚胎冷冻操作时间及体外操作环境的应激因素对胚胎后续发育的影响，达到既提高冷冻保存效果，又不影响其进一步发育潜能的冷冻方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术存在的上述问题，提供一种结合透明带削薄的小鼠胚胎抗应激冻存和解冻方法，本发明通过对透明带进行削薄，配合自制的抗应激冷冻液的使用，能显著提高胚胎冷冻复苏率，保护冷冻胚胎的发育潜能及降低妊娠后的流产率。

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种结合透明带削薄的小鼠胚胎抗应激冻存方法，包括如下步骤：

(1)抗应激冷冻液的配置：所述抗应激冷冻液包括冷冻平衡液和冷冻液；

所述冷冻平衡液采用HTF为基础液，添加体积百分比为7-8％的EG，体积百分比为7-8％的DMSO，体积百分比为11-13％的HSA，150-250um/L维生素C和90-100um/L维生素E；

所述冷冻液采用HTF为基础液，添加体积百分比为12-16％的EG，体积百分比为13-16％的DMSO，0.5M蔗糖，体积百分比为10-15％的HSA，150-250um/L维生素C和90-100um/L维生素E；

(2)胚胎透明带的削薄：小鼠体内受精后第三天卵裂期进行胚胎透明带削薄，取第三天6-10细胞期的胚胎，将胚胎用标尺标注并平均划分为四个区域，将其中一个区域的透明带用激光破膜仪在透明带中部将其削薄，总的削薄区域占胚胎的四分之一，其中激光脉冲宽度0.200ms，孔径2-3um，采用连续激光进行削薄，分三次将透明带削薄四分之一，每次削薄时要调节脉冲轨迹使其与透明带的弧度相吻合，每次连续进行6个脉冲激光削薄，最后在削薄区域的两端将透明带切断；

(3)将削薄的胚胎放入冷冻平衡液中平衡，待胚胎恢复至原体积75-85％，将其转入到冷冻液中在不同液滴间清洗转移，并控制在1分钟之内将胚胎放入到载杆上，迅速浸入到液氮中。

作为优选，步骤(1)中，所述冷冻平衡液采用HTF为基础液，添加体积百分比为7.5％的EG，体积百分比为7.5％的DMSO，体积百分比为12％的HSA，200um/L维生素C和100um/L维生素E；

所述冷冻液采用HTF为基础液，添加体积百分比为15％的EG，体积百分比为15％的DMSO，0.5M蔗糖，体积百分比为12％的HSA，200um/L维生素C和100um/L维生素E。

进一步的，步骤(3)的具体操作步骤如下：