[发明专利]一种结合透明带削薄的小鼠胚胎抗应激冻存和解冻方法

权利要求书

1.一种结合透明带削薄的小鼠胚胎抗应激冻存方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)抗应激冷冻液的配置：所述抗应激冷冻液包括冷冻平衡液和冷冻液；

所述冷冻平衡液采用HTF为基础液，添加体积百分比为7-8％的EG，体积百分比为7-8％的DMSO，体积百分比为11-13％的HSA，150-250um/L维生素C和90-100um/L维生素E；

所述冷冻液采用HTF为基础液，添加体积百分比为12-16％的EG，体积百分比为13-16％的DMSO，0.5M蔗糖，体积百分比为10-15％的HSA，150-250um/L维生素C和90-100um/L维生素E；

(2)胚胎透明带的削薄：小鼠体内受精后第三天卵裂期进行胚胎透明带削薄，取第三天6-10细胞期的胚胎，将胚胎用标尺标注并平均划分为四个区域，将其中一个区域的透明带用激光破膜仪在透明带中部将其削薄，总的削薄区域占胚胎的四分之一，其中激光脉冲宽度0.200ms，孔径2-3um，采用连续激光进行削薄，分三次将透明带削薄四分之一，每次削薄时要调节脉冲轨迹使其与透明带的弧度相吻合，每次连续进行6个脉冲激光削薄，最后在削薄区域的两端将透明带切断；

(3)将削薄的胚胎放入冷冻平衡液中平衡，待胚胎恢复至原体积75-85％，将其转入到冷冻液中在不同液滴间清洗转移，并控制在1分钟之内将胚胎放入到载杆上，迅速浸入到液氮中。

2.如权利要求1所述的结合透明带削薄的小鼠胚胎抗应激冻存方法，其特征在于：步骤(1)中，所述冷冻平衡液采用HTF为基础液，添加体积百分比为7.5％的EG，体积百分比为7.5％的DMSO，体积百分比为12％的HSA，200um/L维生素C和100um/L维生素E；

所述冷冻液采用HTF为基础液，添加体积百分比为15％的EG，体积百分比为15％的DMSO，0.5M蔗糖，体积百分比为12％的HSA，200um/L维生素C和100um/L维生素E。

3.如权利要求1所述的结合透明带削薄的小鼠胚胎抗应激冻存方法，其特征在于，步骤(3)的具体操作步骤如下：

S1、将胚胎放入到第一个冷冻平衡液液滴表面，让其自由下落到液滴底部，在第一个冷冻平衡液液滴中总计停留2min；然后将胚胎转移到第二个冷冻平衡液液滴底部并吹洗3次，在第二个冷冻平衡液液滴中停留1min；再将胚胎转移到第三个冷冻平衡液液滴底部并吹洗3次后，观察胚胎卵裂球情况；

S2、待胚胎恢复至原体积80％时，将胚胎转移到冷冻液液滴中，将胚胎吸取到第一个冷冻液液滴底部，让其飘到液面上部，然后迅速将其转移到第二个冷冻液液滴底部吹洗3次，再次转移到第三个冷冻液液滴底部吹洗3次后，将胚胎迅速转移到载杆上，放入液氮中冷冻保存。

4.如权利要求3所述的结合透明带削薄的小鼠胚胎抗应激冻存方法，其特征在于：步骤S2中，所述胚胎在冷冻液中停留时间控制在60s内。

5.一种小鼠胚胎的解冻方法，其特征在于：取权利要求1-4任一项所述的冻存后的小鼠胚胎，将带胚胎的载杆迅速插入到预热37℃的TS1液中平衡1min后，将胚胎转移到TS2液中平衡3min，再将胚胎转移到TS3液中平衡5min，最后在WS液中平衡5min，转移到培养基中放入培养箱，培养2小时后对胚胎存活情况进行评估，然后继续对存活的胚胎培养至囊胚期至囊胚孵化；

所述TS1液、TS2液、TS3液、WS液均以HTF为基础液进行配置，其中TS1液添加1M蔗糖，200um/L维生素C和体积百分比为12％的HSA；TS2液添加0.5M蔗糖，200um/L维生素C和体积百分比为12％的HSA；TS3液添加0.25M蔗糖，200um/L维生素C和体积百分比为12％的HSA；WS液添加200um/L维生素C和体积百分比为12％的HSA。

6.如权利要求5所述的小鼠胚胎的解冻方法，其特征在于，所述小鼠胚胎具体的解冻操作步骤如下：

A、将带有胚胎的载杆末端插入到预热37℃的TS1液中，用吸管将胚胎与载杆脱离并在TS1液中停留1min；

B、将带有TS1液的胚胎加入到第一个TS2液滴表面让其自由落下，并停留1min，随后将胚胎转入到第二个TS2液滴底部并吹吸3次停留1min，然后将胚胎转入到第三个TS2液滴底部吹吸3次并停留1min；

C、将带有TS2液的胚胎转移到第一个TS3液滴表面，让胚胎自由落下并在液滴中停留1min，随后将胚胎转入到第二个TS3液滴底部并吹吸3次停留2min，然后再将胚胎转入到第三个TS3液滴底部吹吸3次并停留2min；

D、将胚胎转移到第一个WS液滴底部吹吸3次，再将胚胎转移到第二个WS液滴中停留2min，然后转移到第三个WS液滴底部吹吸3次并停留3min，最后转入囊胚培养基中继续培养。