[发明专利]一种基于索烃化的蛋白质偶联方法

说明书

本发明公布了一种基于索烃化的蛋白质偶联方法。本发明将SpyTag‑SpyCatcher复合物中各二级组分(SpyTag,BDTag和SpyStapler)进行重新连线，引入人工设计的链缠结结构，发展了结合缠绕和催化的蛋白质活性模板方法，可实现不同目标蛋白质以索烃形式连接的机械键偶联。利用该方法对无序蛋白质或折叠蛋白质进行异质索烃化，均不会明显影响蛋白质的结构和性能。该索烃化过程还可通过共表达体系实现细胞内直接表达制备。由于索烃结构对目标蛋白质具有构象限制作用和空间控制，它可提升目标蛋白质的稳定性。本发明实现了蛋白质异质索烃的简洁合成，是一种非常有价值的新型蛋白质偶联策略。

技术领域

本发明涉及生物大分子蛋白质的制备，特别涉及通过异质索烃化实现蛋白质的偶联，以及索烃化对提升目标蛋白质稳定性方面的应用。

背景技术

传统的蛋白质偶联主要依赖于共价键偶联，得到线型或支化主链的融合结构，而利用机械键实现的蛋白质偶联例子很少，对于偶联物中蛋白质结构域的空间分布情况也考虑较少。环状结构由于对蛋白质主链构象的限制作用，可提高蛋白质的稳定性。目前，文献中的工作主要针对单个蛋白质进行环化。环化多个蛋白质会较大地削弱其限域作用，从而使得蛋白质稳定性的提升也较为有限。索烃是由两个或多个环状结构通过机械互锁得到的拓扑结构，其中各个目标环状蛋白之间是由机械键相连，并且目标蛋白质的空间分布还可以通过调控目标蛋白质在索烃结构中的相对位置得以调控，故而是一种非常值得探究的新型蛋白质偶联策略。

目前，关于人工蛋白质索烃的制备报道较少。最早的例子是利用天然化学连接法将肿瘤抑制因子p53的缠结二聚基元进行环化，得到p53缠结二聚体的索烃结构(Yan,L.Z.and Dawson,P.E.,Angew.Chem.Int.Ed.2001,113,3737-3739.；Blankenship,J.W.,and Dawson,P.E.,Protein Sci.2007,16,1249-1256)。但该方法基于多肽合成，很难适用于高分子量蛋白质索烃的制备。Zhang课题组利用p53缠结二聚体结合SpyTag-SpyCatcher反应对在胞内先后实现了无序蛋白ELP以及具有折叠蛋白的索烃化，并发现索烃化可以提高目标蛋白质的耐酶解能力、热稳定性以及酶催化活性(Liu,D.,et al,ACS.Cent.Sci.2017,3,473-481；Wang,X.W.and Zhang,W.-B.,Angew.Chem.Int.Ed.2016,55,3442-3446；Wang,X.W.and Zhang,W.-B.,Angew.Chem.Int.Ed.2017,56,13985-13989.)。这些工作得到的都是同质蛋白质索烃，目前尚未有人工蛋白质异质索烃的相关报道。

活性模板合成法是近十多年发展起来的一种制备小分子拓扑结构的有效策略。它既作为反应模板对各反应组分进行预组装，又作为催化中心促进反应组分之间的共价键偶联，从而原位形成机械键，得到包括轮烷和索烃在内的目标拓扑结构。该方法结合了组装和催化，是构建拓扑分子的一种强大手段。然而目前这种策略尚未被用到大分子体系中。

发明内容

本发明设计了适用于制备蛋白质异质索烃的活性模板策略，并发展了若干蛋白质活性模板体系，实现了多种蛋白质异质索烃结构的制备，从而提供了一种新的蛋白质偶联方法。该偶联方法对目标蛋白质的结构及活性没有影响，并在一定程度上提升了目标蛋白质的耐酶解能力、耐热诱导解折叠以及耐冻融变性的能力。