[发明专利]一种快速PCR扩增试剂盒及其应用方法

说明书

本发明提供一种快速PCR扩增试剂盒及其应用方法，所述试剂盒包括DNA聚合酶、dNTPs、内参基因引物群以及缓冲液体系；所述的内参基因引物群包括内参A片段和内参B片段，所述内参A片段包括上游引物F和下游引物R；所述内参B片段包括上游引物F和下游引物R。本发明的PCR扩增试剂盒及其应用方法，结合使用Phire热启动II DNA聚合酶，可实现更长片段靶点的扩增，且错误率较低；试剂盒中添加了PCR增强剂，能够打开核苷酸序列的高级结构；且试剂盒具有便捷、节省资金、提高效率的特点，一步法PCR检测，实现了微量DNA样本快速扩增。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种快速PCR扩增试剂盒及其应用方法。

背景技术

PCR是聚合酶链式反应的简称，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，其研究对生物学各个领域有着深刻的影响，与医、农业、生物工程等的关系十分密切，例如PCR技术涉及在农业上育种的新途径，涉及在医学上检测、治疗遗传疾病，涉及以基因工程为基础的新兴工业，涉及法医物证鉴定、亲子鉴定等。快速PCR包含核酸快速抽提和PCR扩增两部分，经典PCR扩增试剂盒包含PCR缓冲体系、dNTPs、DNA聚合酶等。现有的试剂盒为了配制PCR反应液，会将不同试剂进行反复冻融，每次称量琼脂糖配置凝胶，过程相对繁琐，同时浪费实验耗材。

当前，基因组DNA传统提取方法所提取出来的DNA常含有较多的蛋白残留、多糖的污染、酚类物质的污染(如DNA为褐色)是提取基因组DNA时常遇到的非常棘手的问题，而蛋白、多糖和酚类等杂质对后续的酶切、PCR反应等下游实验有较强的抑制作用。然而，对于极其微量DNA样本，由于PCR扩增反应敏感度低，很难捕捉到有效的DNA信息。对于微量的DNA样本，常规的PCR扩增方法的反应敏感度低是导致后续PCR扩增效果差的主要原因。例如，在法医侦检工作中，犯罪现场的法医学物证的鉴定和检出，对于及时有效地指证犯罪分子，打击犯罪起到至关重要的作用。犯罪现场中指纹、烟蒂、指甲等都含有微量的DNA信息，可为找出或指证犯罪嫌疑人提供科学依据。但由于犯罪现场的DNA残留甚微，采集到的痕迹法医物证DNA极其微量，常规PCR扩增方法的反应敏感度低，难以捕捉到有效DNA信息从而扩增效果较差，直接导致后续的DNA检出率低，STR分型失败，不能指认犯罪个体。

如何利用PCR技术手段，实现实时、便捷、快速监测微量样本基因变异，包括基因突变、缺失、融合等信息，用于临床辅助诊断、靶向用药方案的指导，具有显著的意义，特别是对于技术难点很高的如何实现超微量变异DNA的扩增上。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种实现超微量变异DNA的扩增的快速PCR扩增试剂盒及其应用方法，可适用于基础科研、临床快速PCR扩增等用途。

为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种快速PCR扩增试剂盒，其包括DNA聚合酶、dNTPs、内参基因引物群以及缓冲液体系；所述的内参基因引物群包括内参A片段和内参B片段，所述内参A片段包括上游引物F和下游引物R；所述内参B片段包括上游引物F和下游引物R；其中，所述内参A片段的所述上游引物F的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，所述下游引物R的核苷酸序列为SEQ ID NO：2；所述内参B片段的所述上游引物F的核苷酸序列为SEQ ID NO：3，所述下游引物R的核苷酸序列为SEQ ID NO：4。

优选地，所述内参A片段大小为：200-300bp，所述内参B片段大小为：1000-1100bp。

再优选地，所述的快速PCR扩增试剂盒还包括PCR增强剂，所述的PCR增强剂包含DMSO、甘油、甲酰胺中的一种或两种。

再优选地，所述DMSO的工作浓度为1-10％(v/v)，所述甘油的工作浓度为1-20％(v/v)，所述甲酰胺的工作浓度为1-10％(v/v)。