[发明专利]液相色谱串联质谱测定样品中游离维生素D的方法

说明书

本发明提供液相色谱串联质谱测定样品中游离维生素D的方法。该方法包括：配制不同浓度的游离维生素D标准品溶液；向标准品溶液中加入稳定同位素内标混匀，然后用正己烷提取，上清液用氮气吹干，加入PTAD进行衍生化后氮气吹干，加入复溶液，进行液相色谱串联质谱检测；根据标准品溶液的浓度以及检测到的信号强度绘制标准曲线；用待测样本替代步骤B中的标准品溶液进行检测；根据待测样本的检测结果，对照标准曲线，获得待测样本中游离维生素D的浓度，从而实现对样品中游离维生素D的定量检测。本发明成功建立了液相色谱串联质谱测定样品中游离维生素D的方法，该方法可快速、特异地检测样品(特别是血清)中游离维生素D的含量。

技术领域

本发明涉及液相色谱串联质谱检测技术，具体地说，涉及一种液相色谱串联质谱测定样品中游离维生素D的方法。

背景技术

维生素D是维持人体健康所必需的脂溶性维生素，作为激素类物质调节钙、磷代谢，促进骨骼的健康生长和重构。维生素D主要存在两种形式：麦角钙化醇(维生素D2)和胆钙化醇(维生素D3)，维生素D不能自身合成，只能通过阳光照射皮肤合成维生素D3或外源补充维生素D2或D3。维生素D通过血液循环进入肝脏，转化为25(OH)D，之后在肾脏1α羟化酶CYP27B1的作用下代谢为双羟维生素D[1,25(OH)2D]，进而作用于维生素D受体，发挥生物学效应。维生素D缺乏除直接导致佝偻病和骨质疏松外，也与癌症、心血管疾病、感染、肾病、自身免疫病等免疫系统疾病关系密切。鉴于维生素D对人类健康的重要影响，对于临床医生及研究人员而言，拥有可靠的指标来判断维生素D的营养状态十分重要。1,25(OH)2D是体内维生素D发挥生物学作用的活性形式，但由于其半衰期仅4个小时，所以仅在遗传或获得性维生素D代谢疾病情况下才选择对其进行监测。25(OH)D是血液中主要作用形式，其在体内含量相对较高，半衰期较长(3-4周)，长久以来被认为是监测体内维生素D营养状况的最佳指标。大多数循环25(OH)D(85-95％)与VDBP紧密结合，约10-15％的25(OH)D与白蛋白结合，仅有0.1％的维生素D以游离形式存在。

慢性维生素D缺乏与钙离子吸收降低、PTH升高有关，这些可进一步导致BMD降低。近年来，较少文献报道Free-25(OH)D与BMD相关性，然而结论并不一致，主要采用的Free-25(OH)D检测方法以间接计算法较多。Martin等人纳入265名绝经后BMD较低的妇女，同时检测血清中总25(OH)D、VDBP、白蛋白、并基于多态性rs7041和rs4588的基因分型，鉴定了6种常见的VDBP表型，并根据相应的结合系数计算Free-25(OH)D水平，结果显示血清Free-25(OH)D与BMD相关性优于总25(OH)D。然而近期关于Free-25(OH)D与BMD相关性的瑞士大样本人群研究，结果显示Free-25(OH)D与总25(OH)D具有相同的季节变化趋势，但与总25(OH)D相比，采用直接法检测的Free-25(OH)D与BMD相关性较弱，不能很好地反应人BMD水平。另一篇文章得到的结论和该文较为类似，即对于评估维生素D缺乏，测定Free-25(OH)D并不比总25(OH)D具有额外的优势。上述相似研究，得到的结论却大相径庭，可能与Free-25(OH)D检测方法的差异有关。