[发明专利]液相色谱串联质谱测定样品中游离维生素D的方法

权利要求书

1.液相色谱串联质谱测定样品中游离维生素D的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、配制不同浓度的游离维生素D标准品溶液；

B、对样品进行前处理：向标准品溶液中加入稳定同位素内标混匀，然后用正己烷提取，上清液用氮气吹干，加入PTAD进行衍生化，然后氮气吹干，加入复溶液，进行液相色谱串联质谱检测；

C、根据标准品溶液的浓度以及检测到的信号强度绘制标准曲线；

D、用待测样本替代步骤B中的标准品溶液，采用相同方法进行检测；

E、根据待测样本的检测结果，对照标准曲线，获得待测样本中游离维生素D的浓度，从而实现对样品中游离维生素D的定量检测；

其中，所述样品包括血清、血浆；

步骤D具体如下：用HEPES缓冲液调节血清pH至7.4±0.3，涡旋混匀，37℃水浴30min，取500μl混合物加入超滤管中，37℃，14000g离心30min，取滤液，超滤管截留分子量大小为3KDa；加入500μl生理盐水洗涤，14000g离心30min，取滤液；超滤膜用生理盐水洗3遍，加入500μl无水甲醇洗涤超滤膜，取滤液；将上述滤液合并，取1ml滤液，加入500μl 50-2000pg/mL同位素内标25-羟基维生素D3-d3溶液混匀，然后加入200μl水及2mL正己烷提取，涡旋、离心、取上清，氮气吹干，加入0.01-1mg/mL PTAD溶液50μl，室温放置1h，然后氮气吹干，加入100μl复溶液，准备上机检测；

其中，所述复溶液为含有0.1％v/v甲酸的甲醇溶液与水按1:1体积比混合而成的混合液；

步骤B中所用液相色谱柱为Ascentis Express F5 Column,2.1mm×100mm，2.7μm；进行色谱检测所用流动相如下：

流动相A：含有0.1％v/v甲酸的甲醇溶液；

流动相B：含有0.1％v/v甲酸的水溶液；

液相色谱检测条件如下：柱温为40℃，进样量为50μl；

按以下程序进行梯度洗脱：

步骤B中进行质谱检测，具体监测的离子对以及碰撞能量、去簇电压如下：

采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式；离子源温度为300-600℃；GS1：20-100；GS2：20-100。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤D中同位素内标25-羟基维生素D3-d3溶液的浓度为500pg/mL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤D中PTAD溶液的浓度为0.2mg/mL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，质谱检测的离子源温度为400℃，GS1：55，GS2：75。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，游离维生素D的线性检测范围为3.9-500ng/mL，最低检出限为1.9ng/mL。