[发明专利]一种基于ESR技术检测蛋白中UVA-核黄素体系对多酚氧化的方法

说明书

本发明公开了一种基于ESR技术检测蛋白中UVA‑核黄素体系对多酚的氧化的方法，包括以下步骤：取含有核黄素和多酚的蛋白溶液，加入自由基捕获剂a‑(4‑吡啶基‑1‑氧)‑N‑叔丁基硝基酮，自由基捕获剂终浓度为20～60mM；S2、将步骤S1所得混合溶液进行UVA照射；S3、用毛细管吸取UVA照射后的溶液，进行电子自旋共振检测；本发明应用ESR检测蛋白中UVA‑核黄素体系对多酚的氧化后自由基信号的生成，为蛋白氧化过程中产生的自由基信号的检测提供更快速、准确的方法及明确的规范。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，特别是涉及一种基于ESR技术检测蛋白中UVA-核黄素体系对多酚氧化的方法。

背景技术

核黄素是一种水溶性B族维生素，人体新陈代谢酶系统的一个组成部分，也是生物生命活动中不可缺少的维生素之一，与人体内碳水化合物，脂肪及氨基酸代谢有着密切的关系，在生物学上，核黄素具有重要作用，如：向光性，趋光性和光治疗，其本身又是一类重要的光敏化剂，遇到强光照射，迅速产生自由基。核黄素在其光敏降解过程中可损伤生物大分子，损伤过程被认为是光诱发核黄素释放自由基，并进而造成蛋白、脂质、DNA等生物大分子氧化损伤。本方法可高效、准确的检测出蛋白中UVA-核黄素体系对多酚的氧化过程中自由基的生成。因此，研究核黄素在UVA照射后产生的氧化物，检测其产生的自由基信号种类对于预防损伤具有重要意义。

电子自旋共振(electron spin resonance,ESR)技术是检测自由基最直接最有效的方法，是一种重要的近代物理实验技术。它不仅应用于自由基的检测，还在辐射剂量、电子转移反应、抗氧化的测定以及自由基清除剂等方面发挥着重要的作用。还可以直接测定自由基信号的变化来反映抗氧化剂，清除自由基的多少。捕捉剂ST与自由基R·反应形成的自旋加合物R-ST具有相对较长的寿命而且有特征的ESR波普，可以方便地在ESR波普仪上检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于ESR技术检测蛋白中UVA-核黄素体系对多酚的氧化的方法，以解决利用化学方法检测存在灵敏度和精确度不高的问题，较为准确、快速地检测不同种类自由基。

为了达到上述目的，本发明提供一种基于ESR技术检测蛋白中UVA-核黄素体系对多酚氧化的方法，包括步骤：

S1、取含有核黄素和多酚的蛋白溶液，加入自由基捕获剂a-(4-吡啶基-1-氧)-N-叔丁基硝基酮(POBN)，得混合溶液A；所述混合溶液A中，POBN浓度为20～60mM；

S2、将步骤S1所述混合溶液A进行UVA照射，得混合溶液B；

S3、用毛细管吸取混合溶液B，进行电子自旋共振检测；所述电子自旋共振检测的扫描条件为：中心磁场：3460～3490G；扫描宽度：50～100G；频率：9.75GHz；衰减器：10.00～30.00dB；功率：9.50～10.50mW；接收增益：1.00×10⁵～1.00×10⁶；调制频率：100kHz；调制幅度：1.00G；相位调变：0.00deg；偏移量：0.00％；时间常数：3000.00msec～8000.00msec；转换时间：300.00～400.00msec。

优选方式下，步骤S1所述多酚为海带多酚。

优选方式下，步骤S2所述含有核黄素和多酚的蛋白溶液为含有核黄素和多酚的肌原纤维蛋白溶液。

优选方式下，步骤S1所述含有核黄素和多酚的蛋白溶液的制备方法为：取肌原纤维蛋白用pH 6、25mM磷酸盐缓冲液(含0.6M NaCl)溶解，制备成浓度为30～60mg/mL肌原纤维蛋白溶液，加入核黄素和海带多酚，得含有核黄素和多酚的蛋白溶液；其中，以所述肌原纤维蛋白溶液中肌原纤维蛋白的总量计，每克肌原纤维蛋白添加5～150nmol核黄素；每克肌原纤维蛋白添加10～150μmol海带多酚。