[发明专利]一种小鼠MIP3α-endoglin Fc融合蛋白的制备方法及其用途

说明书

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种小鼠MIP3α‑endoglin Fc融合蛋白的制备方法及其用途，包括：以mMIP3α‑F，R1引物扩模板mouse MIP3α质粒；以F1，mEndoglin‑R引物扩模板mouse Endoglin；以第一轮PCR产物为模板，以mMIP3α‑F，mEndoglin‑R为引物做PCR扩增；pcDNA3.1(+)/Fc质粒和目的片段均使用AflII/BamHI酶切，回收后连接、转化、涂板、筛选。本发明将极有可能大大增强其肿瘤组织靶向性，明显提高其抗肿瘤免疫活性，展示了良好的临床应用价值。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种小鼠MIP3α-endoglin Fc融合蛋白的制备方法及其用途。

背景技术

Endoglin(CD105)是一个TGF-β受体复合物的膜表面糖蛋白分子，在肿瘤组织中特异性高表达，是肿瘤血管生成的标志性分子之一。由于肿瘤新生血管均起源于内皮细胞，所表达的特异抗原物质具有共性，这样就可避免肿瘤由于遗传物质在不断突变所导致的肿瘤抗原的异质性，故针对肿瘤血管内皮细胞的治疗策略不会或只会引起微乎其微的抗药性。由此可见，Endoglin作为肿瘤靶向结合位点优于传统的肿瘤抗原靶点。MIP3α(巨噬细胞炎性蛋白3α)是一种分子量只有9kDa的CC型小分子细胞趋化因子。CC趋化因子受体6(CCR6)是MIP3α的唯一受体。研究表明，MIP3α是DC最重要的特异性趋化因子之一，它通过吸引表达CCR6的未成熟DC趋化于病原感染组织，使DC能够接触处理和递呈抗原。可见，如果设法让肿瘤组织中的MIP3α水平增加，就能够促使DC向肿瘤组织趋化，进而提高DC递呈肿瘤抗原的能力。因此，为了使体内MIP3α趋化募集而来的DC能够更有效地靶向肿瘤细胞并提高其在肿瘤局部杀伤肿瘤细胞的生物活性必须寻找新的有效策略。如何有效提高肿瘤抗原的免疫原性和免疫效果是肿瘤免疫亟待探索的问题，需要另辟蹊径。Fc融合蛋白又称抗体融合蛋白，是利用基因工程技术将具有活性功能的蛋白分子与抗体的Fc段融合所产生的新型功能蛋白。这类融合蛋白不仅保留原功能蛋白的全部生物学活性和长效体内半衰期，而且可以完全取代抗体功能而免疫原性极低，是理想的信号通路阻断剂。研究表明，使用Fc融合蛋白作为肿瘤治疗性抗体除了在动物体内半衰期长外，来源于小鼠的Fc还可以增强抗原提呈细胞对靶抗原的提呈能力，这均大大增强其抗肿瘤免疫效果。

综上所述，现有技术存在的问题是：树突状细胞(dendritic cells，DC)疫苗是当前肿瘤免疫研究的热点。目前制备DC疫苗往往需要通过体外扩增DC，再把患者的肿瘤细胞或人工制备的抗原和扩增的DC细胞进行体外共同培养，让这些DC在体外对抗原进行适当处理修饰后再输回患者体内，但是这些“作坊”式的DC疫苗体外制备方法存在操作复杂、成本高、规范难等不足。因此，寻找一种诱导肿瘤免疫的“体内”DC疫苗方法能够使DC疫苗治疗肿瘤变得更加简单有效，是一种更好的治疗策略。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种小鼠MIP3α-endoglin Fc融合蛋白的制备方法及其用途。

本发明是这样实现的，一种小鼠MIP3α-endoglin Fc融合蛋白的制备方法及其用途，所述小鼠MIP3α-endoglin Fc融合蛋白的制备方法及其用途包括：

步骤一，第一轮PCR:以mMIP3α-F，R1引物扩模板mouse MIP3α质粒；以F1，mEndoglin-R引物扩模板mouse Endoglin；

步骤二，第二轮PCR:以第一轮PCR产物为模板，以m MIP3α-F，mEndoglin-R为引物做PCR扩增；

步骤三，pcDNA3.1(+)/Fc质粒和目的片段均使用AflII/BamHI酶切，回收后连接、转化、涂板、筛选。

进一步，所述步骤一PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸120s，循环25次；72℃充分延伸5min。