[发明专利]一种胎盘间充质干细胞的制备方法

说明书

本发明属于干细胞制备领域，尤其涉及一种胎盘间充质干细胞的制备方法。本发明采用了一种新的酶组合的方法制备胎盘间充质干细胞，即将胎盘组织剪碎成小块，清洗干净后，去除可见血管，获取绒毛膜，再将绒毛膜组织剪碎成肉糜状，加入混合酶溶液，37度震荡消化，稀释消化液，过滤，离心，将沉淀用红细胞裂解液裂解，再离心，加入培养液重悬，置于CO2培养箱中培养，9‑‑12天后消化、收集细胞。其优点是：本发明采用了一种新的酶组合的方法制备胎盘间充质干细胞，使用该方法可以成功收集足量的胎盘间充质干细胞。

技术领域

本发明属于干细胞制备领域，尤其涉及一种胎盘间充质干细胞的制备方法。

背景技术

胎盘间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是一种多能干细胞，是具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞像APSC多能细胞。胎盘间充质干细胞的主要功能在于具有免疫调节作用，通过负性免疫调节功能，抑制机体亢进的免疫反应，使机体免疫功能恢复平衡，从而可以用来治疗造血干细胞移植之后的免疫排斥反应以及克隆氏病、红斑狼疮，硬皮病等自身免疫系统疾病。目前提取胎盘间充质干细胞主要靠酶消化绒毛膜组织，最常用的方法为胶原酶和胰酶混合消化。但是，该方法消化绒毛膜组织的效果并不彻底，获得的原代细胞较少；且消化后的消化液粘稠，影响过滤效果，也会导致原代细胞收获不足。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种新的胎盘间充质干细胞的制备方法，使用该方法可以成功收集足量的胎盘间充质干细胞。

为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

一种胎盘间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)组织块前处理：胎盘于某特定保存液中保存，48h内处理；取出胎盘置于无菌托盘内，剪取胎盘中心鲜红的绒毛膜组织，去除两面的上皮层和钙化层；将绒毛膜组织剪碎为0.8-1.2cm³左右的小块，用清洗液清洗8-10次左右；剔除白色可见血管，将组织块剪碎为肉糜状；

(2)消化离心：加入混合酶溶液消化；血清终止消化，等体积PBS稀释后，过200目滤网；收集滤液离心，沉淀用红细胞裂解液重悬，静置裂解，再离心；沉淀用培养液重悬，接种至培养皿；

(3)培养，收获细胞：培养第3天，更换培养液；培养第6-8天，观察到细胞形成小型集落时，更换培养液；第9--12天，细胞生长接近融合状态, 加入消化液消化细胞，获得胎盘间充质干细胞。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以作如下改进：

进一步的，所述清洗液为含1％双抗的PBS或者生理盐水。

进一步的，所述混合酶溶液为0.5mg/ml胶原酶I、0.1mg/ml Dispasae II、0.25mg/ml DNA酶、0.05％胰酶-EDTA的混合物。

进一步的，所述混合酶消化的方法为，先加入胶原酶I、Dispasae II、DNA酶，37度震荡消化40min；再加入胰酶-EDTA，37度震荡消化 30min；震荡速率为150-160rpm。

进一步的，所述培养液为含有20％胎牛血清的a-MEM或D-MEM培养液。

与现有技术相比本发明的有益效果为：本发明采用了一种新的酶组合的方法制备胎盘间充质干细胞，使用该方法成功收集了足量的胎盘间充质干细胞。

(1)本发明采用Dispasae II消化，有利于组织破碎分散，消化效果更彻底，可以缩短消化时间；

(2)DNA酶消化细胞破碎产生的DNA链，可减少消化液的粘稠度，有利于过滤；

(3)红细胞裂解液可有效破碎红细胞，增加间充质干细胞贴壁概率，利于间充质干细胞生长。