[发明专利]用于上调人DLK1-DIO3印记域非编码RNA表达的sgRNA、重组质粒和细胞株

说明书

本发明公开了一种用于上调人DLK1‑DIO3印记域非编码RNA表达的sgRNA、重组质粒和细胞株。sgRNA序列如SEQ ID NO.1，具体为5’‑TTTATATGGAGGCGCAGAAG‑3’；方法合成为，合成sgRNA序列的核酸片段并插入到MS2‑P65‑HSF1表达质粒载体的多克隆位点并转化，选择单克隆菌株，提取MS2‑P65‑HSF1‑sgRNA‑DLK1‑DIO3重组质粒，将重组质粒转染到已预先转染dCAS9‑VP64质粒的目的细胞株，得到上调DLK1‑DIO3印记域非编码RNA表达的细胞株。本发明能快速、简便、准确上调细胞株中DLK1‑DIO3印记域上非编码RNA的表达。

技术领域

本发明涉及基因编辑及其应用，特别涉及用于上调DLK1-DIO3印记域非编码RNA表达的专用sgRNA引物序列及其应用。

技术背景

基因编辑技术是近年来发展起来的一项基因组修饰技术，可在基因组特定位点进行InDel突变、敲入、多位点突变、小片段删除、以及片段替换等操作。在科学研究领域，基因编辑技术可用于模式生物的快速构建，如特定基因敲除小鼠的构建；在农业领域，该技术可用于动植物品种的优化改造；而在医疗卫生领域，该技术还有可能通过改造人类自身基因，从源头上治疗疾病的目的。因此，基因编辑技术具有极其广泛的应用价值和发展前景。

CRISPR/Cas属于第三代基因编辑技术，其来源于天然存在的原核生物适应性免疫系统。2012年8月，美国加州大学伯克利分校和德国汉诺威医学院的研究人员在《Science》杂志上发表文章，首先报道了该系统的工作原理，其主要可通过向导RNA序列(即sgRNA)的引导来实现对特定基因的编辑。CRISPR/Cas系统经过多年发展，可实现多个哺乳动物系统内高效可靠的RNA导向基因组修饰，从而大幅提高了基因组编辑以及基因组调控的便捷程度。最初发表的有关CRISPR系统的文章，介绍的全都是如何利用CRISPR系统切割DNA的工作。Qi和Jaenisch等人最近构造了一个融合激活蛋白(VP48、VP64、VP96、p65)的无核酸酶活性Cas9蛋白(dCas9-VP64)，通过sgRNA靶向基因启动子序列，激活蛋白募集转录因子，从而可以增强下游靶基因的表达。Jaenisch等将此技术命名为“CRISPR-on”技术(www.crispr-on.org)。

DLK1-DIO3印记域非编码RNA和肿瘤的发生与进展有关，特别是母系表达印记基因(主要是非编码RNA:如miRNAs和少量一些lncRNAs)。这些非编码RNA的转录方向一致，且具有共同的印记调控区基因间DMR(IG-DMR)。在已有的研究中，大多数报道均提示DLK1-DIO3印记域的非编码RNA在肿瘤中的表达受到抑制，提示其可能发挥抑癌作用。因此能够利用CRISPR-on系统全面上调它们的转录和表达，其关键在于sgRNA设计和有效性。

发明内容

为了解决背景技术中存在的问题，本发明目的为利用CRISPR-on技术，鉴于DLK1-DIO3印记域的非编码RNA的成簇分布和同时转录的特征，提供设计了一种针对DLK1-DIO3印记域的特异性sgRNA序列，能快速、简便、准确上调细胞株中DLK1-DIO3印记域上非编码RNA的表达，可进一步利用CRISPR-on系统全面上调它们的转录和表达。本发明的另一目的为提供了一种MS2-P65-HSF1-sgRNA-DLK1-DIO3重组质粒。本发明还提供了上调DLK1-DIO3印记域上非编码RNA表达的细胞株。

本发明的技术方案如下：

一、一种针对DLK1-DIO3印记域启动子区设计的sgRNA序列：序列如SEQ ID NO.1，具体为5’-TTTATATGGAGGCGCAGAAG-3’，这一sgRNA命名为sgRNA(DLK1-DIO3)。定位于DLK1-DIO3印记域上非编码RNA转录起始位点上游-32～-13，长度为20nt。