[发明专利]用于上调人DLK1-DIO3印记域非编码RNA表达的sgRNA、重组质粒和细胞株有效
| 申请号： | 201910496685.6 | 申请日： | 2019-06-10 |
| 公开（公告）号： | CN110305863B | 公开（公告）日： | 2020-12-08 |
| 发明（设计）人： | 徐鑫;郑祥义;王潇;陈世明;李江枫;颜华卿 | 申请（专利权）人： | 浙江大学 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/63;C12N5/10;C12R1/91 |
| 代理公司： | 杭州求是专利事务所有限公司 33200 | 代理人： | 林超 |
| 地址： | 310058 浙江*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 用于 调人 dlk1 dio3 印记 编码 rna 表达 sgrna 重组 质粒 细胞株 | ||
1.一种针对DLK1-DIO3印记域启动子区设计的sgRNA序列，其特征在于：序列如SEQ IDNO.1，具体为5’-TTTATATGGAGGCGCAGAAG-3’，这一sgRNA命名为sgRNA(DLK1-DIO3)，定位于DLK1-DIO3印记域上非编码RNA转录起始位点上游-32～-13，长度为20nt。
2.一种如权利要求1所述sgRNA序列在上调DLK1-DIO3印记域非编码RNA表达量上的应用。
3.一种MS2-P65-HSF1-sgRNA-DLK1-DIO3重组质粒，其特征在于：所述重组质粒包含如权利要求1所述的sgRNA序列。
4.一种如权利要求3所述MS2-P65-HSF1-sgRNA-DLK1-DIO3重组质粒的构建方法，其特征在于：将所述的sgRNA插入到MS2-P65-HSF1表达质粒载体的多克隆位点，得到MS2-P65-HSF1-sgRNA-DLK1-DIO3重组质粒。
5.权利要求3所述的MS2-P65-HSF1-sgRNA-DLK1-DIO3重组质粒在制备上调DLK1-DIO3印记域非编码RNA表达的细胞株中的应用。
6.一种上调DLK1-DIO3印记域非编码RNA表达的细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成权利要求1所述的sgRNA序列；
(2)将步骤(1)中合成的核酸片段插入到MS2-P65-HSF1表达质粒载体的多克隆位点并转化，选择单克隆菌株，提取MS2-P65-HSF1-sgRNA-DLK1-DIO3重组质粒，并测序鉴定获得测序正确的MS2-P65-HSF1-sgRNA-DLK1-DIO3重组质粒；
(3)将步骤(2)中得到的所述MS2-P65-HSF1-sgRNA-DLK1-DIO3重组质粒转染到已预先转染dCAS9-VP64质粒的目的细胞株，得到上调DLK1-DIO3印记域非编码RNA表达的细胞株。
7.一种上调DLK1-DIO3印记域非编码RNA表达的细胞株，其特征在于：
由权利要求6所述构建方法所得。
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