[发明专利]一种用于区分检测Cys/Hcy和GSH的荧光探针及其制备方法

说明书

本发明提供了一种用于区分检测Cys/Hcy和GSH的荧光探针及其制备方法和应用。所述荧光探针的中文名称为10‑(二乙基氨基)‑3‑((7‑硝基苯并[c][1,2,5]恶二唑‑4‑基)氧基)‑5,6‑二氢苯并[c]呫吨12鎓，命名为NBD‑O‑1。本发明提供了一种荧光探针NBD‑O‑1对Cys/Hcy和GSH检测的方法，在PBS(pH 7.4,包含20％CH₃CN,v/v)的溶液中，通过紫外和荧光光谱仪定性区分检测Cys/Hcy和GSH不受常见氨基酸的干扰。更重要的是该探针可以应用于动植物中Cys/Hcy和GSH的检测，该检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确。

技术领域

本发明涉及荧光探针，具体属于一种用于区分检测Cys/Hcy和GSH的荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

巯基对动物，植物和微观生命具有许多有用的特性。随着生物过程的进化，产生了许多氨基酸，包括三种特定的小分子硫醇：半胱氨酸(Cys)，同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)，它们存在于动物，植物和微生物中。同型半胱氨酸(Hcy)结合丝氨酸在胱硫醚b-合酶(CBS)的作用下形成胱硫醚，然后通过胱硫醚g-裂解酶(CSE)的作用分裂成半胱氨酸(Cys)。最终，谷胱甘肽(GSH)由谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCL)和谷胱甘肽合成酶(GS)形成。许多研究表明，三种硫醇的异常浓度可能导致多种人类疾病，如癌症，肝脏损伤，皮肤病和无力等。因此，体内和植物中个体硫醇的特异性检测非常重要。

然而，由于硫醇本身的结构相似性，将一种硫醇与另一种硫醇区分开来仍然是一个巨大的挑战。大多数荧光探针仅在细胞和动物中选择性地检测到硫醇。在模型植物中很少报道对硫醇的不同检测。小分子硫醇在植物生长中起重要作用。天然橡胶是一种重要的工业原料，由于其良好的弹性和耐高温性而备受关注。橡胶胶乳中的硫醇包括GSH，Cys等，其中谷胱甘肽浓度为0.72mmol/L，半胱氨酸浓度为0.44mmol/L。它们可以抵抗由于逆境和老化引起的活性氧物质。体内异常的硫醇浓度会抑制植物的生长。红色荧光探针因其长发射波长和强组织穿透性而众所周知。因此，用于可区分检测硫醇的红色荧光探针的开发在模型植物中迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于区分检测Cys/Hcy和GSH的荧光探针及其制备方法，该制备方法操作方便，原料易得。

本发明的另一目的是提供一种用于区分检测Cys/Hcy和GSH的荧光探针的应用，该探针除了细胞内硫醇的区分检测，还可以用于动植物中Cys/Hcy和GSH的区分检测。

本发明提供的一种用于区分检测Cys/Hcy和GSH的荧光探针，中文名称为10-(二乙基氨基)-3-((7-硝基苯并[c][1,2,5]恶二唑-4-基)氧基)-5,6-二氢苯并[c]呫吨12鎓，英文名称为10-(diethylamino)-3-((7-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-yl)oxy)-5,6-dihydrobenzo[c]xanthen-12-ium，命名为NBD-O-1，结构式为：

本发明提供的一种用于区分检测Cys/Hcy和GSH的荧光探针的合成方法，步骤为：

(1)10-(二乙基氨基)-3-羟基-5,6-二氢苯并[c]呫吨12鎓(化合物1)的制备：将等摩尔量的4-二乙氨基水杨醛和6-羟基-1-四氢萘酮加入圆底烧瓶中，然后加入冰醋酸和高氯酸，加热回流1.5小时，冷却，倒入乙酸乙酯：石油醚＝1:1的溶液中，静置过滤得化合物1；

(2)10-(二乙基氨基)-3-((7-硝基苯并[c][1,2,5]恶二唑-4-基)氧基)-5,6-二氢苯并[c]呫吨12鎓的制备：将步骤(1)制得的化合物1溶于乙醇中，搅拌下加入等摩尔量的(NBD-Cl)，随后加入催化剂量的三乙胺，室温搅拌过夜，然后减压去除溶剂，残留物柱色谱分离得目标产物。

本发明提供的一种区分检测Cys/Hcy和GSH的方法，步骤为：