[发明专利]一种基于点击化学的DNA功能化量子点的制备方法及其在生物标记与检测中的应用

说明书

本发明公开了一种基于点击化学的DNA功能化量子点的制备方法及其在生物标记与检测中的应用。涉及纳米材料和生物医学分析化学领域。其制备方法是在量子点的合成过程中，将一端为叠氮或二苯基环辛炔修饰另一端为硫代磷酸酯修饰的DNA加入，作为量子点的共稳定剂，从而得到叠氮或二苯基环辛炔修饰DNA功能化量子点标记试剂。该量子点标记试剂可对蛋白酶与癌细胞进行高效标记，并可将其用于生物检测与成像分析。结合DNA杂交原理，该标记试剂在纳米材料自组装等方面也具有重要的应用价值。同时，与其他基于点击化学的荧光标记试剂相比，该标记试剂的制备方法简单、无需任何化学修饰、易于纯化且标记试剂的荧光性能优异。

技术领域

本发明涉及纳米材料和生物医学分析化学领域，具体涉及一种叠氮或二苯基 环辛炔修饰DNA功能化量子点及其在生物标记、检测与成像方面的应用。

背景技术

量子点具有优异的光学与化学性能，如发射光谱可调、吸收范围宽、斯托克 斯位移大、量子产率高且稳定性好，因此在生物传感方面得到了广泛的应用(I.L. Medintz etal,Nat.Mater.2005,4,435)。此外，量子点也常用作核酸、蛋白及病毒 等的标记试剂。蛋白等的量子点标记常采用共价偶联的方法，其中碳化二亚胺法 最为常用。但是，碳化二亚胺法存在偶联效率低、副产物多、易水解及标记选择 性差等问题。研究者们发现了一种新型的偶联方式，即生物正交反应，也命名为 点击反应(Q.Wang et al,J.Am.Chem.Soc.2003,125,3192)。最先报道的是铜离 子催化叠氮与炔烃的环加成反应，该方法选择性好、偶联效率高、无水解副产物 且不会发生交叉偶联(J.E.Hein et al,Chem.Soc.Rev.2010,39,1302)。但是该方 法需要Cu⁺作为催化剂，而过量的铜离子不仅会对细胞及生物体造成伤害，还会 猝灭量子点的荧光，因此该方法在荧光纳米材料的标记受到了一定的限制(A.Bernardin et al,Bioconjugate Chem.2010,21,583)。基于张力驱动的叠氮与炔烃的 环加成反应(SPAAC)，除具有铜离子催化叠氮与炔烃的环加成反应的优点外， 该方法还具有不需要催化剂、反应条件温和等优势(N.J.Agard et al,J.Am.Chem. Soc.2004,126,15046)，近年来该方法得到了广泛的应用。

Schieber等人通过SPAAC法将量子点标记于转铁蛋白上，并通过转铁蛋白 与肿瘤细胞表面转铁蛋白受体作用，实现了对肿瘤细胞的成像分析，该方法标记 效率高且不影响蛋白活性(C.Schieber et al,Angew.Chem.Int.Edit.2012,51, 10523)。Hao等人利用SPAAC法将量子点标记于流感病毒的包膜蛋白上，该方 法标记条件温和且效率高(J.Haoet al,Anal.Chem.2012,84,8364)。上述方法需 要将二苯基环辛炔类化合物偶联在量子点表面。量子点的二苯基环辛炔类化合物 修饰主要是通过碳化二亚胺法实现的，该方法会使量子点的荧光效率降低，且稳 定性也会受到一定的影响。因此，需要建立一种简单、有效的方法用于构建基于 点击反应的量子点标记试剂。

加拿大Kelley课题组设计了一类硫代磷酸酯修饰的DNA，并在合成量子点 的过程中引入，一锅法合成了DNA功能化量子点(N.Ma et al,Nat.Nanotech. 2009,4,121)。该方法无需对量子点进行修饰，能保证量子点的发光效率与稳定 性不受影响。其中，正常磷酸酯基的DNA仍然具有靶向性，可与目标核酸、蛋 白及细胞等作用。但是，该量子点只具有靶向作用的单功能性。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供了一种叠氮或二苯 基环辛炔修饰DNA功能化量子点的制备方法，该方法在合成量子点的过程中，加 入叠氮或二苯基环辛炔与硫代磷酸酯共同修饰的DNA，一步合成了叠氮或二苯 基环辛炔修饰的DNA功能化量子点，该量子点标记试剂的发光效率高、稳定性、 易于标记且可具有靶向性。