[发明专利]一种检测橡胶灵芝菌的LAMP引物组合物及其检测方法

说明书

本发明公开了一种用于检测橡胶灵芝菌的LAMP引物组合物及检测方法。本发明的检测橡胶灵芝菌的LAMP引物组合物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。基于该LAMP引物组合物建立的橡胶灵芝菌可视化检测方法，经过LAMP恒温扩增后显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到绿色荧光或出现LAMP特征性的梯形条带。本发明的LAMP引物组合物及其检测方法能在田间实现橡胶灵芝菌的快速、灵敏、准确检测和鉴定，为科学研究和生产实践提供快速、简便、成本低廉的检测技术，为农业生产中由橡胶灵芝菌引起的橡胶红根病的早期诊断及防控提供可靠的技术和理论依据。

技术领域

本发明涉及农作物病害检测鉴定技术和分子生物学技术领域，具体涉及一种用于检测橡胶灵芝菌(Ganoderma pseudoferreum)的LAMP引物组合物、试剂盒和检测方法，可实现由橡胶灵芝菌侵染引起的橡胶红根病的早期诊断、病菌的检测和鉴定。

背景技术

红根病是橡胶树上危害面积最广、影响最大的世界性根部传染性病害。其主要分布在东南亚从印度尼西亚到巴布亚新几内亚和新卡里多尼亚、马来西亚、菲律宾、科特迪瓦等热带地区。在中国所有种植橡胶的地区普遍发生，发病严重林段发病率达40％，若没及时防治，则死亡率为100％。

橡胶红根病为害部位为根系。红根病菌侵染危害橡胶树的侧根和主根。根部受害后地上部分植株表现为树冠稀疏，顶芽抽芽不均匀或抽不出，叶片变小、变黄、卷缩、无光泽；枯枝多，根系坏死，整株死亡。对干胶的产量和质量产生严重影响，从而对植胶区产业造成重大经济损失。

由灵芝菌[Ganoderma pseudoferreum(Wakef.)Overh.et Steinm.；异名：Fomesphilippii Bres.et Henn.,F.pseudoferreus Wakef,Ganoderma philippii(Bres.etHenn.)Bers.]引起的橡胶树红根病分布广，为害重，给橡胶生产上造成严重损失。灵芝菌的寄主除橡胶树外，还有红心刀把木、厚皮树、三角枫、苦楝树、台湾相思、山枇杷、柑橘、可可、咖啡、荔枝、茶树、鸡血藤等。红根病病菌生长缓慢，形态学鉴定困难，防治较为昂贵。当植株地上部表现明显症状时，红根病菌可能已经传染至其他邻近胶树，常错过最佳防治时机。因此确立一种可快速诊断橡胶树红根病菌的早期检测技术，对于生产上指导该病害防治和减少病害损失具有重要的现实意义。

目前对橡胶树红根病菌的检测以病症识别以及组织分离病原菌为主，但传统方法往往耗时长、专业性强、灵敏度低，难以达到快速诊断和检测的目的；利用分子生物学技术检测该病病原菌方法有常规PCR方法(彭军等，2014)，虽然能够较准确检测出病原菌，但需要PCR仪、电泳仪和凝胶成像系统等昂贵的专业仪器设备和分子生物学专业的实验操作人员，不适宜在田间以及基层大规模应用，使病情无法及时、准确的检测及有效防控。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是近年发展起来的应用微生物快速检测的分子生物学技术。该技术可在恒温条件下，利用高活性的链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)对目的DNA片段进行特异性扩增，60～65℃恒温反应30-60min内便能达到109～1010个拷贝数量级。该技术不用进行变性、退火、延伸等一系列温度变化，无需特殊高端的仪器设备，恒温水浴锅即可满足实验需求，具有快速、简便、高效、灵敏、经济等特征。目前该技术已在植保等诸多领域得到广泛应用，极大提高了鉴定效率和准确率。迄今，还未见应用LAMP技术对橡胶树红根病病原菌进行检测的报道，因此建立快速、高效、准确、灵敏、低成本的橡胶树红根病菌LAMP快速检测技术可为橡胶树红根病的发生和防治提供重要的技术手段。

发明内容

本发明的目的是克服传统诊断方法的繁琐、耗时长、准确度低和经验要求高以及PCR检测技术所需昂贵仪器设备、不便在田间直接检测等问题，提供一种橡胶灵芝菌LAMP检测引物以及简便、快捷、灵敏、特异的检测方法。