[发明专利]一种检测橡胶灵芝菌的LAMP引物组合物及其检测方法在审
| 申请号： | 201910493240.2 | 申请日： | 2019-06-06 |
| 公开（公告）号： | CN110093449A | 公开（公告）日： | 2019-08-06 |
| 发明（设计）人： | 贺春萍;董文敏;吴伟怀;李锐;梁艳琼;谢立;易克贤;习金根;郑金龙;黄兴;陆英;谭施北 | 申请（专利权）人： | 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 |
| 主分类号： | C12Q1/6895 | 分类号： | C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93 |
| 代理公司： | 北京惟诚致远知识产权代理事务所(普通合伙) 11536 | 代理人： | 王慧凤;李巍 |
| 地址： | 571101 *** | 国省代码： | 海南;46 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 灵芝菌 橡胶 检测 琼脂糖凝胶电泳检测 可视化检测 恒温扩增 检测技术 绿色荧光 农业生产 生产实践 显色反应 早期诊断 准确检测 红根病 可观察 特征性 种检测 条带 灵敏 科学研究 田间 | ||
1.一种检测橡胶灵芝菌(Ganoderma pseudoferreum)的LAMP引物组合物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。
2.一种检测橡胶灵芝菌(Ganoderma pseudoferreum)的试剂盒，包含权利要求1所述的LAMP引物组合物。
3.根据权利要求2所示的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括PCR反应试剂。
4.一种橡胶灵芝菌(Ganoderma pseudoferreum)LAMP检测方法，其特征在于：利用权利要求1所述的橡胶树红根病菌LAMP引物组合物进行LAMP反应，LAMP反应体系为25μL，包括2.5μmol/L的序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA各2μL；20μmol/L的序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA各1.5μL；10mmol/L dNTPs 3.5μL；25mmol/L MgSO44μL；10mol/L甜菜碱2μL；10×Bst-DNApolymerase buffer 2.5μL；8U Bst 3.0 DNApolymerase 1μL；10～100ng/μL的DNA模板1μL；dd H2O 4μL。
5.根据权利要求4所述的LAMP检测方法，其特征在于：所述LAMP反应条件为60℃～65℃温育60min，85℃灭活8min，终止反应。
6.一种橡胶灵芝菌(Ganoderma pseudoferreum)LAMP快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待检测样品DNA；
(2)以提取的待检测样品DNA为模板，利用权利要求1所述的LAMP引物组合物或权利要求2或3所述试剂盒进行LAMP扩增；
(3)LAMP扩增产物结果观察，判定样品DNA中是否含有橡胶灵芝菌(Ganodermapseudoferreum)，可通过3种方法进行判断：1)通过肉眼直接观察扩增产物颜色，是否有白色浑浊，若有白色浑浊则含有橡胶灵芝菌(Ganoderma pseudoferreum)，反之，则不含有；2)通过2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，是否产生梯形条带，若形成梯形条带则含有橡胶灵芝菌(Ganoderma pseudoferreum)，反之，则不含有；3)加入荧光显色剂，观察扩增产物是否变为绿色，若变为绿色则含有橡胶灵芝菌(Ganoderma pseudoferreum)，若扩增产物保持橙色，则不含有。
7.根据权利要求6所述的LAMP快速检测方法，其特征在于，所述的荧光显色剂为SYBRGreenI。
8.根据权利要求7所述的LAMP快速检测方法，所述LAMP扩增按照权利要求4或5所述的LAMP检测方法进行。
9.权利要求1所述的LAMP引物组以及权利要求2或3所述的试剂盒在检测橡胶灵芝菌中的应用。
10.根据权利要求8所示的应用，其特征在于：所述检测为橡胶灵芝菌引起的橡胶红根病的早期诊断、病原菌鉴定或病害病情监测。
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