[发明专利]甬优4949种子纯度检测的SSR引物及方法

权利要求书

1.甬优4949种子纯度检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、提取待测甬优4949种子的DNA；

S2、以提取的DNA为模板，使用引物对RM72或引物对RM224进行PCR扩增，得

到扩增产物；

其中，引物对RM72包含：正向引物，其从5’端到3’为：CCGGCGATAAAACAATGAG，反向引物，其从5’端到3’为： GCATCGGTCCTAACTAAGGG ；

引物对RM224包含：正向引物，其从5’端到3’为：ATCGATCGATCTTCACGAGG，反向引物，其5’端到3’为：TGCTATAAAAGGCATTCGGG ；

S3、对S2中得到的扩增产物进行凝胶电泳检测；

S4、根据电泳分离出来的条带，只有同时具有亲本特异条带的单株才为真正的甬优

4949种子，其中，引物对RM72产生的母本特异性条带大小为180bp，产生的父本特异性条带大小为150bp，引物对RM224产生的母本特异性条带大小为120bp，产生的父本特异性条带大小为160bp。

2.如权利要求1所述的甬优4949种子纯度检测方法，其特征在于，S1中提取待测甬优4949种子的DNA具体包括：

A1、将待测种子置于离心管中，加入CTAB提取液，水浴；

A2、然后加入体积比为24:1的氯仿和异戊醇，混匀，离心，得到上清液，然后向上

清液中加入异丙醇，混匀，离心，得到沉淀，洗涤，干燥后使用含有RNA酶的双蒸水溶解，即得甬优4949种子的DNA。

3.如权利要求2所述的甬优4949种子纯度检测方法，其特征在于，水浴温度为56℃、时间为20～30 min；加入体积比为24:1的氯仿和异戊醇，混匀，于12000 rpm下离心10min；

向上清液中加入异丙醇，于-20℃下静置1 h，混匀，于4℃下以12000 rpm离心15 min，得到沉淀；使用体积分数为60~70%乙醇洗涤沉淀。

4.如权利要求1所述的甬优4949种子纯度检测方法，其特征在于，S2中PCR扩增反应体系，包括：1 µL的DNA、2 µL的Buffer缓冲液、1 µL的dNTP、1 µL的10 µM的SSR引物、0.4 Unit的Taq DNA聚合酶；

PCR扩增反应程序：95℃变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸60 s，循环35次；72℃延伸5 min，4℃终止反应。

5.如权利要求2所述的甬优4949种子纯度检测方法，其特征在于，A1中CTAB提取液组成为：每1L提取液中含有15 g的CTAB、75 mL1M的 Tris-HCl、30 mLpH为 8.0的EDTA溶液、161.4 g 的NaCl；所述pH为 8.0的EDTA溶液的制备为：将EDTA溶于双蒸水中，并用NaOH调节pH至8.0。

6.如权利要求1所述的甬优4949种子纯度检测方法，其特征在于，S3中凝胶电泳检测具体为：将扩增产物6% 变性聚丙烯酰胺凝胶上于功率为140W下电泳1~1.5h，电泳结束后凝胶用蒸馏水冲洗，用0.2wt%的 AgNO₃溶液染色15min，漂洗 10s，然后含有2wt%的NaOH、0.04wt%的Na₂CO₃、0.4wt% 的甲醛的水溶液，显影至带型清晰。