[发明专利]含有玉米抗菌蛋白的微拟球藻及其转化方法和应用

说明书

本发明公开了一种含有玉米抗菌蛋白的微拟球藻及其转化方法和应用，转化方法包括以下步骤：构建重组质粒、微拟球藻细胞的转化、重组玉米抗菌蛋白z108β在微拟球藻细胞中的表达及重组玉米抗菌蛋白z108β的提取和纯化。该玉米抗菌蛋白在微拟球藻中转化的技术方法具有易于操作、玉米抗菌蛋白生产成本低、获得的玉米抗菌蛋白纯度高的优点；另外，玉米抗菌蛋白通过微拟球藻在水体中表达其多肽以分泌蛋白的形式释放到水中，对于净化水体、消除微生物污染，优化水源起到重要的作用，在水生生物养殖的防病治病、养殖水体的净化有着潜在的应用价值。

技术领域

本发明涉及基因重组技术领域，具体为一种玉米抗菌蛋白在微拟球藻中转化的技术方法。

背景技术

玉米抗菌蛋白是一种II型核糖体失活蛋白（RIP），是植物体内一种抑制异源生物体活性的防卫蛋白，其主要功能表现在水解后的蛋白RIP具有两个肽链—α肽和β肽，两个肽链都有活性，其中α肽具有N-糖苷酶活性，而β肽具有类凝聚素的Lectin活性。从玉米胚芽中获得的z108基因经过重组以后，在大肠杆菌表达的重组蛋白对于黄曲霉（A. flavus）等多种病原菌具有抑制孢子萌发的作用，是一种具有抗菌特点的防卫蛋白；而它的β肽链能够独立地与细胞表面的糖元或半乳糖结合，抑制甜菜夜蛾（S. exigua）等害虫的取食，表现出一种抑制鳞翅目昆虫生长的作用。这种抗菌蛋白来自于植物自身的合成产物，不会对人体产生负面的影响，将其应用到动物、植物的防病治病当中，具有环保和对人体无害的优势。

微拟球藻（Nannochloropsis oceanica），是海洋微藻大眼藻纲的主要种群，因其富含蛋白质、色素及多不饱和脂肪酸（特别是二十碳五烯酸，EPA）等，并具有生长迅速，繁殖速度快，细胞颗粒小等优点，是一种重要的经济微藻。由于体积微小，适用于口径小的鱼虾类，目前主要作为优良的鱼虾饵料或饲料添加剂，同时具有重要的生态学和经济学价值，也是目前公认的最有希望用于工业化的高产油海水藻。

在过去的研究中，已经将玉米的核糖体失活蛋白基因z108转移到大肠杆菌BL21中，在实验室条件下提取、纯化并获得重组的抗菌蛋白。例如2010年获得了一项发明专利（一种玉米抗菌蛋白的基因及其编码蛋白的应用ZL200810014139.6）。

发明内容

鉴于此，本发明提供了一种玉米抗菌蛋白z108β多肽在微拟球藻中转化的技术方法，具体涉及通过基因转化的方法将玉米抗菌蛋白的基因z108β转入微拟球藻中使其表达，并进行细胞培养，利用微拟球藻作为生物反应器来生产重组玉米抗菌蛋白z108β，获得可以生产重组玉米抗菌蛋白z108β的微拟球藻，并提取玉米抗菌蛋白z108β。该玉米抗菌蛋白在微拟球藻中转化的技术方法具有易于操作、玉米抗菌蛋白生产成本低、获得的玉米抗菌蛋白纯度高的优点。

本发明的技术方案如下：

一种玉米抗菌蛋白在微拟球藻中转化的技术方法，具体步骤如下：

（1）构建重组质粒

载体质粒pBA002用双酶切，与经双酶切后的玉米蛋白中的z108基因连接，获得连接产物，将连接产物转化到大肠杆菌DH5a中，获得重组质粒载体pBA002-z108β及其菌株pBA7786，将菌株于-70℃保存；

（2）微拟球藻细胞的转化

S1，用试剂盒提取重组质粒载体pBA002-z108β的DNA，用于基因枪法基因转化；