[发明专利]含有玉米抗菌蛋白的微拟球藻及其转化方法和应用

权利要求书

1.含有玉米抗菌蛋白z108β基因的微拟球藻。

2.玉米抗菌蛋白在微拟球藻中转化的方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）构建重组质粒

载体质粒pBA002用双酶切，与经双酶切后的玉米蛋白中的z108β基因连接，获得连接产物，将连接产物转化到大肠杆菌DH5a中，获得重组质粒载体pBA002-z108β及其菌株pBA7786，将菌株于-70℃保存；

（2）微拟球藻细胞的转化

S1，用试剂盒提取重组质粒载体pBA002-z108β的DNA，用于基因枪法基因转化；

S2，将微拟球藻置入直径为60mm的无菌培养皿内，调节微拟球藻的细胞密度为1×10⁶-8×10⁶个/mL，备用；

S3，当阻挡网与材料间距3-9cm时，对上述已调节细胞密度的微拟球藻细胞团进行轰击，轰击压力为1100 psi；

S4，轰击后的微拟球藻细胞加入F/2培养液，在23-25℃条件下遮光恢复培养48小时，获得培养液Ⅰ；

S5，向培养液Ⅰ中加入浓度为10-40mg/L的草丁膦溶液，培养14天，获得培养液Ⅱ；

（3）重组玉米抗菌蛋白z108β在微拟球藻细胞中的表达

S1，将培养液Ⅱ均匀涂布在带有滤纸的培养皿中，挑取绿色的微拟球藻转化体细胞，加入培养液单独培养，获得培养液；

S2，对培养液中的微拟球藻转化体细胞进行PCR、RT-PCR检测，并进行玉米抗菌蛋白表达检测；

（4）重组玉米抗菌蛋白z108β的提取和纯化

S1，微拟球藻转化体细胞内重组玉米抗菌蛋白的提取

取0.1g微拟球藻转化体放入液氮中研磨，加入1×样品缓冲液200μL，混合后煮沸5min，12000rpm离心10min；弃掉沉淀，保留上清液；

S2，利用SDS-PAGE电泳鉴定

取20μL上清液，用于点样检验；电泳条件为：80V电压电泳30分钟后，电压120V电泳60-80分钟；用考马斯亮蓝染色，脱色后观察；

S3，重组蛋白的浓缩和保藏

将离心纯化的蛋白集中收集，离心纯化后的重组玉米抗菌蛋白z108β在-20℃条件下保存。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，载体质粒pBA002用XbaI/SacI双酶切，与pUCm-T-1192中的插入序列z108β基因连接，其连接产物转化到大肠杆菌DH5a中，获得重组质粒载体pBA002-z108β及其菌株pBA7786，-70℃保存。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（2）的S1中，调节微拟球藻的细胞密度为5×10⁶个/mL，转化时，用直径60mm的无菌培养皿，将细胞均匀平铺滤纸片中部，形成直径2cm左右的圆形轰击圈。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（2）的S3中，采用PDS-1000\He型基因枪进行基因转化；阻挡网与材料间距为3cm。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（2）的S4中，轰击后的微拟球藻细胞加入F/2培养液，培养温度是25℃，遮光恢复培养48小时。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（2）的S5中，培养条件：温度：23-25℃；光照培养14小时、暗培养10小时，光照为2500-3500Lux；草丁膦筛选浓度为20mg/L。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（3）的S1中，所述培养液为F/2培养液，每5天更换一次营养液；培养条件：温度23-25℃；光照培养14小时、暗培养10小时，其中，光照为2500-3500Lux。