[发明专利]应用枯草芽孢杆菌群体响应调控系统合成MK-7的方法

说明书

本发明公开了应用枯草芽孢杆菌群体响应调控系统合成MK‑7的方法，属于遗传工程领域。本发明通过对磷酸激酶KinA截短突变，并用组成型启动子P_veg表达，使细胞能够在培养基营养丰富的情况下产生芽孢信号。应用本发明方法得到受Phr60‑Rap60群体响应调控的Spo0A系统，通过对MK‑7合成途径的动态调控，实现了MK‑7的高效合成，不需要额外诱导剂，实现了目标产物高效合成与细胞生长之间的动态平衡。最终得到的枯草芽孢杆菌重组菌BS19、BS20摇瓶发酵生产MK‑7的产量分别高达170mg/L、360mg/L，是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的17.89、37.89倍。

技术领域

本发明涉及应用枯草芽孢杆菌群体响应调控系统合成MK-7的方法，属于遗传工程领域。

背景技术

七烯甲萘醌(MK-7)是一类重要的脂溶性维生素，作为γ-谷氨酸羧化酶的辅因子，在调节钙的分配、促进骨骼发育逆转骨质疏松以及在保护血管，防止动脉粥样硬化和心血管疾病反应中起到重要作用。由于七烯甲萘醌对人体具有更好的亲和性和更长的半衰期，得到人们更多的关注。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)常被广泛用在食品酶制剂及重要营养化学品的生产中，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是高效合成MK-7的有效途径。然而，MK-7的合成途径十分复杂，导致重要前体磷酸烯醇式丙酮酸PEP大部分流向三羧酸TCA循环，而使得分支酸的合成受到限制，另外，异戊二烯焦磷酸也是细胞壁合成的重要物质，如果敲除则会抑制细胞的生长；MEP途径中间产物1-羟基-2-甲基-2-丁烯基4-二磷酸酯(HMBPP)和二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP)均对细胞有毒性。如何调整枯草芽孢杆菌代谢流供给，增加MK-7的合成是一个值得深入探讨的问题。

九州大学Hanai.T教授课题组采用来自费氏弧菌(Vibrio fischeri)的LuxR群体响应调控系统，在大肠杆菌中实现了碳流从中心代谢途径到异丙醇途径的自动切换。麻省理工学院Prather.K教授课题组利用来自玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii)的Esa系统，将EsaR的结合位点整合至大肠杆菌果糖磷酸激酶(pfkA)基因的启动子区，抑制了pfkA基因的转录，产物肌醇的产量提高了5.5倍。然而这些研究均使用异源的群体响应系统进行调控，细胞代谢负担加重，系统稳定性较弱，而若利用细胞自身的群体响应系统对代谢网络进行动态调控，则不会对细胞的代谢造成额外负担。在七烯甲萘醌的研究中还未有使用群体响应动态调控的研究报道。

发明内容

为了解决上述存在的技术问题，本发明构建了Phr60-Rap60-Spo0A的群体响应动态调控系统，并改造P_spoiia和P_abrb启动子，获得受Spo0A-P调控转录活性不同的启动子库，并将获得的启动子动态调控七烯甲萘醌合成途径中关键基因HepS/T、ispH、pyk和uppS，最终得到的枯草芽孢杆菌重组菌BS19、BS20摇瓶发酵生产MK-7的产量分别高达170mg/L、360mg/L，分别是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的17.89、37.89倍，且重组菌BS20在发酵罐中发酵3天，MK-7的产量可达230mg/L。

本发明的第一个目的是提供一种应用枯草芽孢杆菌群体响应调控系统合成MK-7的方法，所述方法包括在枯草芽孢杆菌的染色体上进行了如下改造：

(1)将组氨酸激酶KinA的基因进行截短突变并且进行了组成型表达，同时敲除组氨酸激酶KinB的基因；

(2)将含有P_hag启动子的Rap60基因整合到染色体上，并在染色体上Rap60基因下游整合两个拷贝的信号分子Phr60的表达框；