[发明专利]酿脓链球菌的CRISPR核酸酶SpCas9 的截短变异体及其应用

说明书

本发明属于蛋白质工程技术领域，具体为来源于酿脓链球菌的CRISPR核酸酶SpCas9的截短变异体及其应用。本发明中，CRISPR‑Cas9（TSpCas9）核酸酶属于CRISPR‑Cas9系统，具有野生型CRISPR‑Cas9核酸酶相当的剪切活性，所述CRISPR‑Cas9（TSpCas9）核酸酶是将野生型CRISPR‑Cas9核酸的氨基酸序列截掉120个即第180位到299位的氨基酸后重组所得；所述野生型CRISPR‑Cas9核酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；或者所述CRISPR‑Cas9核酸酶含有如SEQ ID NO.7所示90%的氨基酸序列，即SEQ ID NO.15。该截短变异体可用于基因组编辑、基因打靶、基因组工程、表观基因组工程、基因治疗与体外诊断。

技术领域

本发明属于蛋白质工程技术领域，具体涉及来源于酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes) 的CRISPR核酸酶SpCas9的蛋白质工程，及其在基因组编辑、基因组打靶、表观基因组工程和体外诊断中的应用。

背景技术

由细菌免疫系统经漫长进化而产生的CRISPR-Cas9系统是一种革命性的基因编辑技术，被称为“基因魔剪”，可方便地对基因组特定基因的DNA链进行高效切割编辑，在生物医学领域有巨大的应用潜力，如进行基因组编辑、基因组打靶、表观基因组工程和体外诊断等^[1-11]。

来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的CRISPR-Cas9核酸酶SpCas9最目前最为广泛使用的CRISPR核酸酶^[12]。截至目前，该技术也被广泛应用到多个领域，包括医学研究以及生物技术等，比如细胞或动物模型的构建快速、功能基因的筛选便捷以及部分遗传疾病的治疗彻底^[13-24]。

该系统的出现，大大克服了传统编辑技术耗时长的缺点，仅需数周就可以实现过去利用传统技术耗时一年之久才能完成的编辑^[8]。除此之外，该技术在体内编辑不仅可以大规模、高特异地进行，而且还可以减少花费，节约成本。

虽然，CRISPR-Cas9系统的优势促使其能够广泛应用于许多领域，并最近在医学领域的研究上也异军突起，但是，许多挑战仍然悬而未决，尤其是寻找一个适合并高效将CRISPR-Cas9 靶向特异性疾病组织的运载系统，至今成为临床应用的瓶颈问题。

以现在的科学技术和认知，欲将感兴趣的基因靶向运载到体内或细胞当中，需要借助一些病毒载体，如腺病毒和慢病毒(具有致癌性)等。不过，腺病毒存在的不足(如缺少高效的包装细胞，制备复杂，滴度低的缺陷)，尤其装载量较小(小于4.7kb)的自身特性限制了将编码区大于4kp的SpCas9+sgRNA靶向运载到体内和细胞的靶标位置^[25]。因此，基于这个问题，考虑将SpCas9缩小到适合的大小，以实现腺病毒将小型的SpCas9装载，并高效靶向运载到靶位点，从而以期作为临床医学治疗上的优势工具，具有极大潜在医学价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种来源于酿脓链球菌的CRISPR-Cas9核酸酶SpCas9的截短变异体及其用途。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

本发明提供一种体积比野生型小的CRISPR-Cas9核酸酶(TSpCas9)，其是将野生型的 SpCas9第180位到299位氨基酸截掉所得，属于CRISPR-Cas9系统，具有野生型CRISPR-Cas9 (SpCas9)相当的剪切活性。

所述野生型SpCas9核酸酶的核苷酸序列和氨基酸序列分别为SEQ ID NO.6和SEQID NO.7 所示。

所述CRISPR-Cas9核酸酶(TSpCas9)的核苷酸序列和氨基酸序列分别为SEQ IDNO.15和SEQ ID NO.16所示，与野生型SpCas9的相似度达90％以上。