[发明专利]纯化的双阴性T细胞及其制备和应用

说明书

本发明提供了一种去除了IL‑17分泌细胞的DNT细胞群。本发明还提供了该DNT细胞群的制备方法和应用，其具有显著的抑制T细胞增殖、诱导凋亡的作用，还可以抑制脂肪组织炎症、改善胰岛素抵抗、减轻糖尿病、缓解脂肪性肝炎，也可以用于抗原特异性的过敏性哮喘的预防和治疗。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，更具体地涉及一种纯化的双阴性T细胞及其制备和应用。

背景技术

双阴性T细胞(Double negative T cells，DNT细胞)是一种表型独特的TCRαβ+T淋巴细胞，不表达CD4、CD8、NK等细胞的特征表面标志。虽然DNT细胞在人、小鼠外周血和淋巴器官中仅占总T淋巴细胞的1％-3％，但越来越多的研究证明这种罕见的T细胞群在免疫系统中起着关键和多样化的调节作用。

多数研究表明DNT细胞对于维持机体抗原特异性的免疫稳态具有至关重要的作用。DNT细胞高表达穿孔素、颗粒酶B和FasL，对CD4和CD8T细胞、B细胞、树突状细胞和NK细胞等均表现出很强的免疫抑制活性，从而可以下调机体过度的免疫反应，从而达到抑制移植排斥反应、避免移植物抗宿主病的发生以及有效控制自身免疫性疾病的发生和发展。由于DNT细胞高表达颗粒酶和穿孔素等细胞杀伤相关蛋白，也可用于肿瘤细胞的杀伤治疗。基于这些发现，将DNT细胞体外扩增，用于器官移植排斥反应、移植物抗宿主病、自身免疫性疾病，乃至肿瘤预防和治疗的研究不在少数，这些研究主要提取人外周血或小鼠脾细胞中的单个核细胞，去除CD4、CD8和CD56(人)/NK1.1(小鼠)后进行扩增，将扩增后的细胞进一步除去CD4、CD8和CD56(人)/NK1.1(小鼠)后用于过继转移治疗。

尽管研究发现DNT细胞具有抗原特异性的免疫抑制，例如可以针对性的预防和治疗移植排斥反应和自身免疫性糖尿病，但由于DNT细胞缺乏CD4分子这一辅助T细胞识别MHC-II分子的关键分子，对于DNT细胞如何保留对MHC-II抗原的特异性识别仍不清楚。因此，本领域迫切需要对DNT细胞及其应用进行进一步的深入研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种纯化的双阴性T细胞及其制备和应用。

在本发明的第一方面，提供了一种细胞制剂，所述的细胞制剂包含DNT细胞群，并且所述的DNT细胞群中，占总细胞数量95％以上的细胞不分泌表达IL-17，较佳地，98％以上，更佳地，99％以上，最佳地，99.9％以上。

在另一优选例中，所述的DNT细胞群中，占总细胞数量95％以上的细胞具有表面抗原CD3+和TCRαβ。

在另一优选例中，所述的DNT细胞群中的细胞CD3正常或低表达、TCRαβ正常或低表达。

在另一优选例中，所述的DNT细胞群中，占总细胞数量95％以上的细胞不表达选自下组的表面标志物：CD4、CD8、NK1.1(小鼠)/CD56(人)、或其组合。

在另一优选例中，所述的DNT细胞群中，占总细胞数量95％以上的细胞表达选自下组的基因：CCR5、CXCR3、B220、FasL、NKG2D、Perforin、Granzyme B、或其组合。

在另一优选例中，所述的DNT细胞群中，占总细胞数量50％以上,较佳地70％以上,更佳地90％以上的细胞高表达LAG3基因。

在另一优选例中，所述的高表达指所述细胞LAG3基因的表达量G1与正常CD4T细胞LAG3基因的表达量G0的比值，即G1/G0≥1.2，较佳地≥1.5，更佳地≥2。

在另一优选例中，所述的低表达指所述细胞中特定基因的表达量R1与正常CD4T细胞中相应基因的表达量R0的比值，即R1/R0≤1，较佳地≤0.8，更佳地≤0.5。

在另一优选例中，所述的DNT细胞群中的细胞具有抗原特异性。