[发明专利]通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法

说明书

本发明公开了一种通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ‑谷胺酰转肽酶的方法，以该菌株为出发菌株，包括以下步骤：取液体培养基置于三角瓶中，按1‑10％v/v的接种量接入菌体种子，进行摇瓶发酵，发酵条件为20‑40℃，100‑300rpm，发酵培养48h后，将发酵液离心去除菌体，取上清液用硫酸铵盐析法纯化，即得γ‑谷胺酰转肽酶，所述液体培养基包括麦芽糖、玉米粉、酵母膏和无机盐，所述无机盐浓度比为1：5‑5：1的MgSO₄·7H₂O和K₂HPO₄·3H₂O混合物。该发酵工艺方法通过优化培养基种类和浓度，获得了较高活性和抑菌作用的γ‑谷胺酰转肽酶。该制备工艺简单、条件易控制,适合工业化生产。

技术领域

本发明涉及一种异源二聚体酶制备方法，特别是涉及一种γ-谷胺酰转肽酶制备方法，应用于生物工程技术领域。

背景技术

γ-谷氨酰转肽酶(γ-Glutamyl transpeptidase,GGT)是包含一个大亚基(～40kDa)和一个小亚基(～20kDa)的异源二聚体酶，能够催化γ-谷氨酰类物质(如谷胱甘肽)的γ-谷氨酰键的断裂，并且转移γ-谷氨酰基到其他的氨基酸或肽类物质。在生物体内，GGT主要的生理功能是参与γ-谷氨酰循环，为细胞转运氨基酸类物质。GGT广泛存在于细菌、真菌、植物和哺乳动物中，不同生物中的GGT存在位置不同：在细菌中，GGT位于周质空间或者是分泌到胞外环境中；在哺乳动物细胞内，GGT绑定在血浆膜的外表面；在植物细胞中，GGT存在非原质体和液泡中。

γ-谷氨酰转肽酶作为催化β-谷氨酰基部分向受体转移的酶，具有多种生化功能，主要用于合成多种食品及医药功能性γ-谷氨酰基化合物，如L-茶氨酸，具有镇静减压、增强免疫力和预防肿瘤等重要作用，但在生鲜农产品防腐保鲜的报道较少。γ-谷氨酰转肽酶的生产方法有多种，有化学合成法、基因重组法和微生物发酵法，但是，通过化学法合成具有副产物多，合成周期大、产量较少等缺点；而微生物发酵法是目前最常见的方法之一，与其他方法相比，该法具有生产条件可工业化、生长周期相对较短等优点。目前我国通过微生物发酵法制备γ-谷胺酰转肽酶存在生产成本高及提取工艺复杂等缺点，难以实现大规模工业化生产和应用，这成为亟待解决的技术问题。

发明内容

为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，采用优化发酵工艺中的培养基处方，获得高活性具有抑菌作用的γ-谷氨酰转肽酶，本发明发酵工艺方法通过优化培养基种类和浓度，获得了较高活性和抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶，制备工艺简单，条件易控制，成本低，适合工业化生产。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，采用枯草芽孢杆菌株进行发酵，制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶。

作为本发明优选技术方案，一种制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，包括如下步骤：

(1)微生物发酵过程：

取液体培养基置于三角瓶中，以枯草芽孢杆菌株与液体培养基的体积比为菌体种子的接种量，按1-10％v/v的接种量接入枯草芽孢杆菌株的菌体种子，在三角瓶中得到发酵原液，进行摇瓶发酵，发酵条件为20-40℃，控制摇瓶转速为100-300rpm，进行发酵培养至少48h，得到发酵液；优选上述液体培养基包括麦芽糖、玉米粉、酵母膏和无机盐，优选上述无机盐为质量浓度比为1:5-5:1的MgSO₄·7H₂O和K₂HPO₄·3H₂O的混合盐；

(2)γ-谷胺酰转肽酶的分离和纯化过程：

将在所述步骤(1)中制备的发酵液经过离心除去菌体，取上清液用硫酸铵盐析法纯化，即得溶菌酶。