[发明专利]一种牙鲆弹状病毒检测试纸及其制备方法

权利要求书

1.一种牙鲆弹状病毒检测试纸，包括载体板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜检测层、吸水垫，所述样品垫和吸水垫分别位于载体板的两端，硝酸纤维素膜检测层位于所述载体板的中部，所述金标垫一端位于样品垫的下方，另一端位于硝酸纤维素膜检测层的上方，其特征在于所述金标垫上载有胶体金标记的抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体HIRRV-G-4D10，所述硝酸纤维素膜检测层上依次喷涂有检测线和质控线，所述检测线靠近样品垫侧，质控线靠近吸水垫侧；所述检测线包被抗牙鲆弹状病毒M蛋白的单克隆抗体HIRRV-M-1F9和HIRRV-M-4D10的混合单克隆抗体，质控线包被羊抗小鼠IgG，所述抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体HIRRV-G-4D10由保藏号为CCTCC NO：C201869的杂交瘤细胞株分泌；所述单克隆抗体HIRRV-G-4D10、HIRRV-M-1F9和HIRRV-M-4D10是通过以下方法制备的：利用Trizol法提取牙鲆弹状病毒总RNA逆转录后获得cDNA，以cDNA产物为模板，PCR扩增G基因的61-1524 nt片段与M蛋白基因全长，分别连接pET-28a、pET-32a载体构建重组表达质粒pET-28a-G与pET-32a-M，将其导入感受态大肠杆菌后经诱导表达、亲和层析纯化获得重组G蛋白与M蛋白，以亲和纯化的重组G蛋白与M蛋白作为抗原免疫Balb/c小白鼠，采用细胞融合法制备杂交瘤细胞，利用免疫学检测筛选方法，筛选出分泌抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株HIRRV-G-4D10与抗牙鲆弹状病毒M蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株HIRRV-M-1F9和HIRRV-M-4D10，采用常规方法扩大培养所得到的杂交瘤细胞株，腹腔注射BALB/c小鼠取腹水，采用辛酸-硫酸铵法进行纯化获得抗HIRRV的三种单克隆抗体。

2.如权利要求1所述的牙鲆弹状病毒检测试纸，其特征在于所述抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体HIRRV-G-4D10能与分子量为60 kDa牙鲆弹状病毒蛋白条带发生特异性反应。

3.如权利要求1所述的牙鲆弹状病毒检测试纸，其特征在于所述抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体HIRRV-G-4D10具有牙鲆弹状病毒中和活性。

4.一种制备如权利要求1所述的牙鲆弹状病毒检测试纸的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）单克隆抗体HIRRV-G-4D10、HIRRV-M-1F9和HIRRV-M-4D10的制备：

利用Trizol法提取牙鲆弹状病毒总RNA逆转录后获得cDNA，以cDNA产物为模板，PCR扩增G基因的61-1524 nt片段与M蛋白基因全长，分别连接pET-28a、pET-32a载体构建重组表达质粒pET-28a-G与pET-32a-M，将其导入感受态大肠杆菌后经诱导表达、亲和层析纯化获得重组G蛋白与M蛋白，以亲和纯化的重组G蛋白与M蛋白作为抗原免疫Balb/c小白鼠，采用细胞融合法制备杂交瘤细胞，利用免疫学检测筛选方法，筛选出分泌抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株HIRRV-G-4D10与抗牙鲆弹状病毒M蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株HIRRV-M-1F9和HIRRV-M-4D10，采用常规方法扩大培养所得到的杂交瘤细胞株，腹腔注射BALB/c小鼠取腹水，采用辛酸-硫酸铵法进行纯化获得抗HIRRV的三种单克隆抗体；所述抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体HIRRV-G-4D10由保藏号为CCTCC NO：C201869的杂交瘤细胞分泌；

（2）金标垫的制备：

① 胶体金与金标抗体的制备：

采用微波炉-柠檬酸三钠还原法制得颗粒大小为20-30nm的胶体金，用0.1mol/L碳酸钾溶液调节胶体金pH值为8.2，将抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体HIRRV-G-4D10按照18μg/ml加入胶体金中，再加入稳定剂5%的BSA经离心纯化后用金标保存液悬起，即为金标单克隆抗体液体；

② 载有金标单克隆抗体的金标垫的制备：

将制成的金标单克隆抗体液体喷涂到玻璃纤维上，冷冻干燥；

（3）硝酸纤维素膜检测层的制备：

将调整好浓度的抗牙鲆弹状病毒M蛋白的单克隆抗体HIRRV-M-1F9和HIRRV-M-4D10的混合单克隆抗体和羊抗小鼠IgG喷涂于硝酸纤维素膜检测层上，分别作为检测线和质控线，晾干后封闭液中浸泡，37℃烘干备用；

（4）牙鲆弹状病毒检测试纸的制作：

在载体板上依次贴上硝酸纤维素膜检测层、吸水垫、金标垫和样品垫，进行切条，即成牙鲆弹状病毒检测试纸。