[发明专利]一种基于RPA快速检测水稻恶苗病菌藤仓镰孢的方法

说明书

本发明公开了一种基于RPA快速检测水稻恶苗病菌藤仓镰孢的方法。本发明提供的引物对由序列表的序列1和序列2所示的两条引物组成。本发明还建立了水稻恶苗病菌藤仓镰孢的快速检测方法。本发明中所设计的引物可以有效扩增靶基因，特异性和灵敏性更高，可用于由水稻恶苗病菌藤仓镰孢的快速检测，精准防控该病害的发生与流行。

技术领域

本发明涉及植物保护领域，具体涉及一种基于RPA快速检测水稻恶苗病菌藤仓镰孢的方法。

背景技术

水稻恶苗病(rice bakanae disease)是严重影响水稻生长发育的真菌病害之一，通过带菌种子进行传播，病稻草也是其主要初侵染源。在我国分布广泛，其发生严重时可致使水稻减产50％以上。其发病症状主要表现为叶鞘叶片狭长，叶色呈现淡黄色，发病植株徒长，相较健康植株细高，而根系发育不良，根长变短且有倒生根，根毛少。水稻种子萌发后，病菌从芽鞘、根与根冠等部位侵染秧苗致病。病株上产生的恶苗病菌的分生孢子可从伤口侵入秧苗，引起发病。水稻开花时，病菌的分生孢子传染到健康的小穗上，最终形成带菌种子。在机械脱粒时，病种子的分生孢子会污染其他无病种子，致使其带菌，再次引起病菌的扩散。因而，水稻的全生长季都可能感染恶苗病菌，引起发病。

近年来，水稻恶苗病在我国的发病率逐渐上升，发病面积愈来愈大，严重影响我国水稻生产。水稻恶苗病菌的有性态为藤仓赤霉复合种(Gibberella fujikuroi speciescomplex,GFC)。目前研究表明，水稻恶苗病主要由层出镰孢(F.proliferatum)、拟轮枝镰孢(F.verticillioides)、藤仓镰孢(F.fujikuroi)和F.andiyazi导致的。其中层出镰孢、拟轮枝镰孢、藤仓镰孢为藤仓赤霉的复合种(GFC)。GFC复合种至少由10个不同交配群(A-J)组成，拟轮枝镰孢属于交配群A，藤仓镰孢属于交配群C，层出镰孢属于交配群D。GFC复合种种内成员形态特征非常相似，难以区分，藤仓镰孢与层出镰孢的一些基因序列也非常相似。藤仓镰孢是水稻恶苗病的主要病原菌，致病力最强，分布最广。

目前应用的水稻恶苗病病原菌的检测方法包括传统的鉴定方法和基于PCR的分子生物学技术。但这些技术检测结果准确度偏低，检测所需时间较长，或依赖于精密的仪器设备等。因此，建立便捷、特异、高效的水稻恶苗病菌藤仓镰孢的检测方法迫在眉睫。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)技术是高效、特异的核酸等温扩增技术。该技术由多种酶和蛋白参与，仅需设计2条特异性引物，在20分钟内即可实现核酸指数扩增的新技术，具有反应灵敏、操作简便的特点。RPA技术自开发以来，已被应用于生命科学等多个领域，为农业生产上的病害鉴定与检测也提供了更高效的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于RPA快速检测水稻恶苗病菌藤仓镰孢的方法。

本发明首先保护引物对，由引物F和引物R组成；

所述引物F为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物R为如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。

所述引物F根据编码链设计；所述引物R根据互补链设计。

所述引物对的用途为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4):

(b1)鉴定或辅助鉴定待测病菌是否为藤仓镰孢；