[发明专利]一种双荧光标记的重组菌及其制备方法和在研究耐药基因体内转移中的应用

说明书

本发明提供了一种双荧光标记的重组菌及其制备方法和在研究耐药基因体内转移中的应用，属于耐药基因研究技术领域，所述重组菌以大肠杆菌为原始菌株，在所述大肠杆菌的基因组上整合有红色荧光标记基因；所述大肠杆菌内有携带绿色荧光标记基因的接合性质粒RK2。本发明中所述重组菌的基因组上携带红色荧光蛋白基因和绿色荧光蛋白基因；并且所述携带绿色荧光标记基因的接合性质粒RK2能够通过结合作用转入到其他种类细菌细胞内，通过荧光信号检测能够准确的确定通过结合作用转入绿色荧光蛋白的细菌的种类和分布；便于不同种类细菌耐药性强弱的判断以及细菌耐药性产生部位的判断。

技术领域

本发明属于耐药基因研究技术领域，尤其涉及一种双荧光标记的重组菌及其制备方法和在研究耐药基因体内转移中的应用。

背景技术

抗菌药物通过杀灭细菌发挥治疗感染的作用，细菌作为一类广泛存在的生物体，也可以通过多种形式获得对抗菌药物的抵抗作用，逃避被杀灭的危险，这种抵抗作用被称为“细菌耐药”，获得耐药能力的细菌就被称为“耐药细菌”。细菌耐药是一种被人类强化的自然现象。所谓细菌的耐药性，是指细菌多次与药物接触后，对药物的敏感性减小甚至消失，致使药物对耐药菌的疗效降低甚至无效。随着抗生素药物的广泛使用，细菌耐药性问题已成为严重影响人类健康的问题之一，耐药基因作为细菌耐药的物质基础，近年来成为人们关注的热点。

而耐药基因在体内转移情况及能转移给哪些受体菌，由于缺乏适当的分选和分析技术，暂时还不清楚。目前，已有很多文献报道了绿色荧光蛋白基因及其衍生物在细菌瞬时表达，质粒的水平转移，病原菌侵入细胞途径及监测体内细菌的迁移和变化等方面的应用。目前尚没有在细菌耐药基因水平转移应用方面的研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种双荧光标记的重组菌及其制备方法和在研究耐药基因体内转移中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种双荧光标记的重组菌，所述重组菌以大肠杆菌为原始菌株，在所述大肠杆菌的基因组上整合有红色荧光标记基因；所述大肠杆菌内有携带绿色荧光标记基因的接合性质粒RK2。

优选的，所述大肠杆菌为E.coliATCC 47076。

优选的，所述红色荧光标记基因通过同源重组的方式整合到所述大肠杆菌的基因组上aslA酶切位点和aslB酶切位点之间。

本发明提供了所述的重组菌的制备方法，包括以下步骤：

1)构建携带红色荧光标记基因的打靶载体；

2)将所述打靶载体转入原始菌株大肠杆菌中获得基因组上整合有红色荧光标记基因的第一重组菌株；

3)将携带有绿色荧光标记基因的接合性质粒RK2转入所述第一重组菌株中获得双荧光标记的重组菌。

本发明提供了所述的重组菌在研究耐药基因体内转移中的应用。

优选的，所述应用包括以下步骤：

1)用所述重组菌喂食动物18～22d后，解剖所述动物，并收集粪便细菌和肠道细菌；

2)检测所述粪便细菌或肠道细菌的荧光信号，若所述粪便细菌或肠道细菌中出现绿色荧光信号，说明所述粪便细菌或肠道细菌接受了重组菌中的接合质粒，易于产生耐药性；若所述粪便细菌或肠道细菌中没有出现绿色荧光信号，说明所述粪便细菌或肠道细菌没有接受重组菌中的接合质粒，不易产生耐药性。

优选的，步骤1)中所述动物为斑马鱼。

优选的，所述重组菌喂食的量为1～9×10⁸CFU/d/条。

优选的，所述粪便细菌和肠道细菌的收集采用流式细胞分选实现。