[发明专利]稳定表达CD163受体蛋白的重组质粒、重组慢病毒和猪肺泡巨噬细胞系及其构建方法

说明书

本发明提供了一种稳定表达CD163受体蛋白的重组质粒、重组慢病毒和猪肺泡巨噬细胞系及其构建方法，属于生物技术领域。该重组质粒是以慢病毒表达载体pLV‑sfGFP[2A]Puro为基础构建的，并整合有CD163编码基因。本发明提供的这种稳定表达CD163受体蛋白的重组质粒、重组慢病毒和猪肺泡巨噬细胞系及其构建方法，采用特殊的慢病毒系统将CD163基因整合到永生化的PAM细胞染色体上，使得永生化的PAM细胞系能够永久性地稳定表达CD163蛋白，而使细胞易受PRRSV感染。PRRSV在该细胞系(mPAM‑CD163)上的毒价可以高达10^6.9TCID₅₀/0.1mL，且能够稳定传代。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种稳定表达CD163受体蛋白的重组质粒、重组慢病毒和猪肺泡巨噬细胞系及其构建方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)在上世纪90年代初出现在欧洲和美国，此后成为全球养猪业的一个严重问题。PRRS是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种持续的、严重的疾病，其特征是不同年龄段的猪呼吸道问题、生长性能差以及怀孕母猪生殖障碍。由于该病持续的亚临床感染及病毒的高度变异性和抗体反应不能完全免于病毒再感染和再出现，控制该疾病的措施变得复杂。目前，PRRSV几乎在全球每一个养猪国家都存在，并且呈现出一种严峻的流行态势，成为危害全球养猪业最为严重的疾病之一。

PRRSV的增殖具有非常严格的宿主嗜性。原代猪肺泡巨噬细胞(pPAM)和血液单核细胞是对PRRSV感染敏感的猪源细胞。PRRSV主要通过呼吸道和生殖道粘膜侵入动物机体，通过作用于pPAM在动物肺部引起强烈的炎症反应，继而在猪体出现典型的呼吸道症状。随着PRRSV的大量复制，在病毒感染后期，PAM细胞出现大量破裂溶解，PRRSV随着血液和淋巴液循环到达体内各组织器官。PRRSV可以导致宿主机体的持续性免疫抑制。另外，该病毒极易发生变异，容易出现免疫逃避、病毒持续感染的现象，并且容易诱导广范围的继发感染，使其他的病原微生物侵入机体。

然而，由于pPAM细胞不仅难以获得，而且不能方便地保存或长期使用。同时，在一些PRRSV流行国家(例如中国)，很难获得源自PRRS抗原和抗体双阴性猪的pPAM。虽然已经有报道了永生化的PAM细胞系(mPAM)，但由于该细胞系不能表达PRRSV感染所需的受体蛋白CD163，使得该细胞系不能被PRRSV感染。因此，这就严重制约了感染PAM与宿主免疫细胞之间作用机制等方面的研究，进而难以有效控制PRRSV。另一方面，当前PRRSV疫苗工业化生产中采用的细胞是MARC-145细胞，高致病性PRRSV(HP-PRRSV)在该细胞上的毒价较低，一般是10⁴-10⁶TCID₅₀/0.1mL，导致疫苗的生产效率还有较大的提升空间。

鉴于此，本申请提供一种能够稳定表达CD163受体蛋白的重组质粒、重组慢病毒和猪肺泡巨噬细胞系。

发明内容

本发明的目的在于提供一种稳定表达CD163受体蛋白的重组质粒、重组慢病毒和猪肺泡巨噬细胞系及其构建方法，为研究PRRSV感染PAM与宿主免疫细胞之间的相互作用等提供有力工具，也为显著提升PRRSV疫苗的工业化生产效率提供了一种更加高效、实用的细胞。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种用于CD163受体表达的重组质粒及其构建方法，具体如下：

一种用于CD163受体表达的重组质粒，重组质粒是以慢病毒表达载体pLV-sfGFP[2A]Puro为基础构建的，并整合有CD-163编码基因。

一种上述重组质粒的构建方法，其包括：

对CD163基因进行PCR扩增，并将CD163基因克隆至pEASY-T1载体中，得到载体pEASY-T1-CD163；