[发明专利]稳定表达CD163受体蛋白的重组质粒、重组慢病毒和猪肺泡巨噬细胞系及其构建方法

权利要求书

1.一种用于CD163受体表达的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒是以慢病毒表达载体pLV-sfGFP[2A]Puro为基础构建的，并整合有CD-163编码基因。

2.一种根据权利要求1所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，其包括：

对CD163基因进行PCR扩增，并将CD163基因克隆至pEASY-T1载体中，得到载体pEASY-T1-CD163；

从所述载体pEASY-T1-CD163上将CD163基因克隆至所述慢病毒表达载体pLV-sf GFP(2A)Puro中，用限制性内切酶Xba I和Xho I分别对所述pEASY-T1-CD163和所述pLV-sf GFP(2A)Puro进行双酶切；

用DNA连接酶将酶切得到的CD163基因产物和pLV-sf GFP(2A)Puro产物进行连接，得到重组质粒pLV-EGFP-CD163。

3.根据权利要求2所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，对所述CD163基因进行PCR扩增的引物对为：

CD163-F：GCTCTAGAGCCACCATGGACAAACTCAGAATGGTGCTAC；

CD163-R：CCCTCGAGTCATTGTACTTCAGAGTGGTCTCCTG。

4.根据权利要求3所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，对所述CD163基因进行PCR扩增的条件为：92-96℃下预变性6-8min；93-95℃下变形25-35s,50-60℃下退火40-50s,67-77℃下延伸50-70s,共30-40个循环；再于67-77℃下延伸8-12min。

5.根据权利要求3所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，所述CD163基因来源于原代猪肺泡巨噬细胞。

6.一种用于CD163受体表达的重组慢病毒，其特征在于，其通过将权利要求1-5任一项所述的重组质粒转染哺乳细胞所得。

7.根据权利要求6所述的重组慢病毒，其特征在于，所述哺乳细胞为Lenti-X 293T细胞系。

8.一种稳定表达CD163受体的猪肺泡巨噬细胞系，其特征在于，其通过将权利要求6或7所述的重组慢病毒转导至永生化的猪肺泡巨噬细胞系中并进行筛选得到。

9.一种稳定表达CD163受体的猪肺泡巨噬细胞系的构建方法，其特征在于，其包括：

培养永生化的猪肺泡巨噬细胞系3D4/21至细胞密度达到70-80％；再与权利要求6或7所述的重组慢病毒混合，于35-39℃、4-7％CO₂下培育6-8h；采用含有嘌呤霉素的培养基培养1-2周，每3-4d更换新的含有嘌呤霉素的培养基，直至出现单克隆细胞；挑选所述单克隆细胞，采用有限稀释法进行筛选。

10.根据权利要求9所述的稳定表达CD163受体的猪肺泡巨噬细胞系的构建方法，其特征在于，所述嘌呤霉素的浓度为最佳筛选浓度，其通过下述方法获得：

培养所述永生化的猪肺泡巨噬细胞系3D4/21至细胞密度达到70-80％，换成含有不同浓度的嘌呤霉素的培养基，在3-5d内能杀死所有细胞的最小嘌呤霉素的浓度为所述最佳筛选浓度。