[发明专利]一种游离型非甲醇诱导毕赤酵母表达载体的构建及其应用

说明书

本发明涉及一种游离型非甲醇诱导毕赤酵母表达载体的构建及其在酶重组表达中的应用，属于基因工程技术领域。本发明所述非甲醇诱导毕赤酵母表达载体是将乳酸克鲁维酵母自主复制序列PARS2和毕赤酵母启动子P_GCW14序列插入载体骨架，属于带自我复制序列的游离型载体构建得到的。利用该载体构建的游离型重组毕赤酵母工程菌相对通用的整合型重组毕赤酵母工程菌，分泌生产重组酶的能力显著提升。此外，其发酵原料来源广泛，生产成本较低。

技术领域

本发明涉及一种游离型非甲醇诱导毕赤酵母表达载体的构建及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

毕赤酵母表达系统主要包括诱导型表达系统和组成型表达系统。诱导型表达系统中常使用启动子为甲醇代谢启动子P_AOX1，通过甲醇诱导的表达系统相对于组成型表达系统也有自身的一些劣势。第一，生产时间长，毕赤酵母系统所使用的诱导剂为甲醇，而毕赤酵母对甲醇的利用率和同化效率都较低，其菌体生物量在诱导阶段增长十分缓慢，过量的甲醇积累甚至会对菌体产生一定毒性，与此相应，目标蛋白在诱导阶段的积累速度也较慢，导致生产时间较长。第二，毕赤酵母为好氧微生物，甲醇的代谢也需要大量的氧气，这直接导致溶氧成为生产过程中的限制因素。第三，毕赤酵母在表达外源蛋白时需要大量甲醇作为碳源和诱导剂，大量甲醇的长时间储存带来了安全隐患，另外，甲醇还属于剧毒物质，不适用于食品方面的应用，因而制约了P_AOX1表达载体在食品领域的大规模应用。组成型表达系统是最近几年广泛使用的毕赤酵母表达系统，其中三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(P_GAP)是较为常用的同生长相偶联的组成型表达系统启动子，可以利用甘油或者葡萄糖等碳源生长并高效表达外源基因，具有不需要更换碳源、操作便捷、发酵周期短、耗氧低的优点。组成型表达系统对于表达食品行业用酶制剂具有重要的意义。

外源基因可以整合进宿主基因组进行表达，也能以游离质粒的形式进行表达。整合型表达具有遗传稳定的优点，而游离型表达具有拷贝数高的优点，所以通过构建游离型载体表达异源蛋白的潜力巨大。

广义的木聚糖酶是指能将半纤维素木聚糖彻底降解的一组酶的总称，包括内切β-1,4-木聚糖酶(endo-1,4-β-D-xylanohydrolase EC 3.2.1.8.)、β-1,4,-木糖苷酶(β-1,4,-D-xylanxlylohydrolase EC 3.2.1.37)、α-L-呋喃阿拉伯糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase EC 3.2.1.55)、乙醛木聚糖苷酶和α-葡萄糖醛酸等，其中内切β-1,4-木聚糖酶是降解木聚糖主要的酶。能够生产木聚糖酶的微生物已经达到几十个属、一百多个种，包括细菌、真菌、放线菌等，本发明采用Streptomyces sp.FA1来源的木聚糖酶(XynA,GenBank accession no.JX560161)作为重组表达基因材料。

从上世纪70年代开始，木聚糖酶的应用领域从工业饲料生产发展到食品、造纸、能源等多个行业领域。在造纸方面，木聚糖酶可以通过使纸浆中的纤维降解，增大纤维细胞壁的通透性，使木素更容易提取出来，同时，破坏木素碳水化合物的连接，加大漂白液与木素的接触程度，从而使漂白效果显著增强且降低漂白废液对环境的污染。在饲料方面，添加木聚糖酶可以降低木聚糖表现出抗营养现象，减少食糜黏度，使消化酶与食物相接触，增加动物养分吸收利用率。在食品方面，可以用于面制品烘焙，能够改善面制品的品质。在保健食品中，木聚糖酶水解木聚糖β-1,4-糖苷键使其形成可溶性戊糖混合物，改善人们对非消化性碳水化合物的吸收，帮助人体控制体重和血糖、吸收营养物质和预防疾病等功能。迄今为止，国内外已报道了400多种木聚糖酶基因，大多数木聚糖酶在野生菌中表达量仅在10-20IU/mL。而通过非甲醇诱导表达载体在毕赤酵母中表达相同来源的木聚糖酶基因，经高密度发酵后，其发酵上清重组木聚糖酶的表达量也不高于343U/mL。