[发明专利]一种游离型非甲醇诱导毕赤酵母表达载体的构建及其应用在审
| 申请号： | 201910476834.2 | 申请日： | 2019-06-03 |
| 公开（公告）号： | CN110184291A | 公开（公告）日： | 2019-08-30 |
| 发明（设计）人： | 吴敬;胡梦凯;夏伟;吴丹 | 申请（专利权）人： | 江南大学 |
| 主分类号： | C12N15/81 | 分类号： | C12N15/81;C12N1/19;C12N9/24;C12R1/84 |
| 代理公司： | 哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司 23211 | 代理人： | 彭素琴 |
| 地址： | 214000 江苏*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 毕赤酵母 表达载体 非甲醇 游离型 构建 重组毕赤酵母 诱导 工程菌 乳酸克鲁维酵母 基因工程技术 序列插入载体 自主复制序列 游离型载体 发酵原料 生产重组 载体构建 重组表达 自我复制 启动子 通用的 整合型 分泌 生产成本 应用 | ||
1.一种游离型非甲醇诱导的毕赤酵母表达载体，其特征在于，所述游离型非甲醇诱导的毕赤酵母表达载体是将自主复制序列PARS2和毕赤酵母启动子PGCW14序列插入载体骨架，构建获得的游离型非甲醇诱导表达载体，所述自主复制序列PARS2含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述启动子PGCW14含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的毕赤酵母表达载体，其特征在于，所述毕赤酵母表达载体为pGCW14ZαA-PARS2，所述pGCW14ZαA-PARS2是将质粒pGAPZαA中的PGAP启动子替换成启动子PGCW14，再将核苷酸序列如SEQ ID NO:1的PARS2复制子连接到pGCW14ZαA质粒上得到游离型非甲醇诱导毕赤酵母表达载体pGCW14ZαA-PARS。
3.含有权利要求1或2所述毕赤酵母表达载体的细胞。
4.如权利要求3所述的细胞，其特征在于，表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的木聚糖酶。
5.如权利要求3所述的细胞，其特征在于，表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的β-甘露聚糖酶。
6.如权利要求3-5任一所述的细胞，其特征在于，所述毕赤酵母为毕赤酵母KM71、GS115或SMD168。
7.一种权利要求3-6任一所述细胞的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)合成自主复制序列PARS2和启动子PGCW14序列；将质粒pGAPZαA中的启动子PGAP用启动子PGCW14替换，获得pGCW14ZαA质粒；
(2)将所得PARS2基因与质粒pGCW14ZαA相连，得到表达载体pGCW14ZαA-PARS2；
(3)将目的基因与步骤(2)中的表达载体pGCW14ZαA-PARS2相连，得到重组载体；
(4)将重组载体转化到毕赤酵母中，得到所述毕赤酵母重组菌。
8.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述转化使用电击转化法。
9.权利要求3-7任一所述的细胞在生产木聚糖酶或β-甘露聚糖酶中的应用。
10.权利要求1或2所述的毕赤酵母表达载体在饲料、食品、纺织或化工领域的应用。
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