[发明专利]一种基于RGO-CS-Fc/Pt NPs纳米复合材料检测胆固醇的方法

说明书

本发明公开了一种基于RGO‑CS‑Fc/Pt NPs纳米复合材料检测胆固醇的方法，首先在活化处理基础丝网印刷电极，表面通过电沉积法形成一层金纳米粒子，将RGO‑CS‑Fc修饰至电极表面，再通过恒电位沉积法使铂离子在电极表面电还原形成Pt NPs，然后利用RGO‑CS‑Fc的良好生物相容性、高比表面积、高电子转移效率以及高酶负载特性，吸附大量的胆固醇酶构建出酶电极，联合胆固醇酶和Pt NPs的催化放大效果，胆固醇发生分解并产生H₂O₂，最后根据检测H₂O₂的氧化还原伏安电流值，绘制工作曲线，实现对胆固醇的高灵敏检测。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种复合材料构建酶电极检测胆固醇的方法。

背景技术

目前用于检测胆固醇（Cholesterol）的技术主要是基于酶法的分光光度法、比色法、荧光法、化学法等。公开号为CN108776163A的发明专利，公开一种由丝网印刷电极及吸附在所述丝网印刷电极表面的物质识别酶膜（由胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶、聚乙烯醇、壳聚糖、碳纳米管混合制备而成）构建出胆固醇酶生物传感器，然后通过电化学检测胆固醇的方法。CN103954660A的发明专利，公开一种采用经典的三电极体系构建的胆固醇酶生物传感器，其中工作电极上固化特定的物质识别酶膜，所述物质识别酶膜主要由石墨烯、硫堇、胆固醇氧化酶、辣根过氧化物酶及壳聚糖混合制备而成，得到所述酶生物传感器。这些方法有的是对环境的要求较高，且导电性不好，或者方法操作步骤多，价格昂贵，或者是费时且技术要求高等缺点，需要建立一种快速、灵敏、操作简单的胆固醇检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用石墨烯-壳聚糖-二茂铁复合材料（RGO-CS-Fc）结合铂纳米粒子（Pt NPs）构建酶电极，再使用电化学方法检测胆固醇的方法，以解决目前的生物传感器的易受环境影响和导电性不好、技术要求高等问题。

本发明的检测原理为：利用RGO-CS-Fc复合纳米材料的良好生物相容性、高比表面积、高电子转移效率以及高酶负载特性，吸附大量的胆固醇酶构建出酶电极，改善了酶电极的初始电化学性能以及稳定性；联合胆固醇酶和Pt NPs的高效催化协同增强对胆固醇的催化作用，构建酶生物传感器，采取电流-时间（i-t）法对胆固醇进行检测，根据传感器的电流响应与胆固醇浓度的关系绘制出工作曲线，实现对胆固醇的高效灵敏检测。本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：

步骤1：RGO-CS-Fc复合纳米材料的制备

（1）称取氧化石墨烯（GO）粉末置于超纯水中，制成氧化石墨烯溶液后，然后将水合肼与石墨烯溶液充分混溶然后在水浴中加热，充分反应，高速离心取沉淀溶于超纯水得到还原型氧化石墨烯（RGO）溶液。

（2）制备壳聚糖-二茂铁（CS-Fc）溶液：将乙酸滴入壳聚糖中溶解得到壳聚糖-乙酸溶液，向壳聚糖-乙酸溶液中加二茂铁甲酸得到壳聚糖-二茂铁溶液。

（3）RGO-CS-Fc复合纳米材料的制备：将RGO溶液与壳聚糖-二茂铁溶液混合，搅拌离心，去上清液，余下的黑色沉淀用二次蒸馏水洗涤后离心，得到RGO-CS-Fc纳米复合材料。

步骤2：RGO-CS-Fc/Pt NPs修饰的胆固醇酶电极的构建

（1）将丝网印刷电极（SPCE）置于硫酸溶液中进行电化学循环伏安扫描活化，用纯水冲洗干净。

（2）将活化后的电极浸入氯金酸（HAuCl₄）溶液中进行恒电位沉积，用纯水冲洗晾干备用。

（3）取RGO-CS-Fc纳米复合材料于蒸馏水中，形成RGO-CS-Fc纳米复合材料分散液。将复合材料分散液修饰在（2）已处理好的丝网印刷电极表面，纯水冲洗晾干备用。