[发明专利]一种基于RGO-CS-Fc/Pt NPs纳米复合材料检测胆固醇的方法

权利要求书

1.一种基于RGO-CS-Fc/Pt NPs纳米复合材料检测胆固醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：RGO-CS-Fc复合纳米材料的制备

（1）将10 mg GO分散于10 mL超纯水中，使用细胞超声破碎仪超声形成1mg/mL石墨烯的悬浮液，在离心机中以3000 r/min的速度离心，取上清液得到10 mL浓度为1 mg/mL的GO溶液；

（2）将100 mL质量分数为80%的水合肼与GO溶液混溶，水浴加热，反应4小时，以10000r/min的速度离心；取沉淀溶于超纯水，得到10 mL浓度为1 mg/ml的RGO溶液；

（3）将1%的乙酸滴入0 .2 mg的壳聚糖中溶解成10 mL的溶液，向壳聚糖-乙酸溶液中加入2 mg二茂铁甲酸、1 mL浓度为10 mM的EDC和4 mL浓度为10 mM的NHS溶液，搅拌4 h后，取10 mL浓度为1 mg/mL的RGO溶液混合，搅拌12 h，高速离心，转速20000 r/min，时间30 min；除去上清液，重新分散于超纯水中得到10 mL浓度为1 mg/mL的RGO-CS-Fc纳米复合材料溶液，于4°C冰箱冷藏；

步骤二：RGO-CS-Fc/Pt NPs修饰的胆固醇酶电极的构建

（1）丝网印刷电极的活化：将丝网印刷电极浸入5 mL浓度为0 .5 M的H₂SO₄溶液中，通过电化学以100 mV/s的扫描速度在为0 .2 V至1 V的电压范围循环扫描活化；

（2）金纳米颗粒修饰：将活化后的SPCE电极浸入持续搅拌的5 mL质量分数为0 .01%的HAuCl₄溶液中，通过电化学在-0 .5 V电位下进行恒电位电沉积120s，在活化的SPCE表面沉积Au NPs，得到SPCE/ Au NPs 电极；

（3）敏感单元的修饰：将2 μL浓度为0 .4 mg/mL的RGO-CS-Fc溶液滴在SPCE/Au NPs的电极表面，在25℃恒温条件下孵育30分钟，使用超纯水洗去未牢固结合的RGO-CS-Fc纳米复合材料，晾干；然后将SPCE/Au NPs/RGO-CS-Fc电极浸入搅拌的5 mL分子质量为0 .01%的H₂PtCl₆溶液中，通过电化学在-0 .5 V电位下进行恒电位电沉积90 s，在活电极表面沉积PtNPs，使用超纯水洗去残留的H₂PtCl₆溶液，晾干，连续重复以上步骤三次；将2 .0 mL浓度为0.5 mg/mL的CHODCHER酶溶液滴到电极表面，在15°C恒温的潮湿环境中孵育1小时，将CHODCHER吸附到电极表面，使用超纯水洗去残留的CHODCHER溶液，晾干；

步骤三：胆固醇工作曲线的绘制

将构建好的传感器电极置于2 mL浓度为0 .1 M的PBS，通过电化学工作站使用i-t测量方法在室温下外加-0 .5 V的电位测量基线，当曲线稳定后，将10 μL标准胆固醇溶液加入PBS溶液中，记录产生的电化学信号；在胆固醇浓度为0 .1-10mg/mL的范围内，传感器电流响应与胆固醇浓度呈良好的正相关线性关系，标准曲线为I=13 .76396 c+72 .29672；

步骤四：实际样本中的胆固醇检测

将构建好的传感器电极置于2 mL浓度为0 .1 M的PBS，再通过电化学工作站使用i-t测量方法在室温下外加-0 .5 V的电位测量基线，当曲线稳定后，将10 μL血清样本加入PBS溶液中，记录产生的电化学信号，通过标准曲线计算胆固醇的浓度。