[发明专利]一种单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法

说明书

本发明提供了一种单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法，包括如下步骤：利用N组含有不同浓度的同位素D₂O标记的培养基培养氨氧化古菌，并对所述氨氧化古菌细胞菌液进行离心、洗涤、风干，再选取一定量的细胞区域进行拉曼光谱的测定，根据N组培养基中所述同位素D₂O的浓度和计算获得的C‑D％绘制标准曲线，获取回归方程；提供氨氧化古菌样品进行代谢活性分析。上述方法可用于定量分析氨氧化古菌的代谢活性，该方法是进行原位检测，检测速度快、检测精度高、样品消耗量少、对细胞菌体没有破坏性，适用范围广。

技术领域

本发明涉及生物活性检测，尤其涉及一种单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法。

背景技术

氨氧化古菌能够合成氨单加氧酶(AMO)，从而催化氨氧化作用，将氨氧化为NO₂^-。氨氧化古菌驱动了硝化作用的开始，主导了全球氮元素循环的中心环节。所以测定氨氧化古菌在环境中的活性对判断环境中氮循环过程非常重要。

通常采用测定氨氧化古菌氨氧化速率的方法直接体现其代谢活性：(1)¹⁵N同位素收支平衡法是指通过添加¹⁵N标记的NO₃^-，新合成的NO₃^-对系统中的¹⁵NO₃^-起到稀释的作用，通过气相色谱-同位素质谱技术检测NO₃^-中¹⁵N同位素的丰度，来推算氨氧化过程的速率，(2)抑制法是一些化学试剂阻断氨氧化过程，通过检测NH₄⁺的积累的量反推算氨氧化速率。但这两种方法均存在检测精度较低、不能测定特定类群氨氧化速率的缺点。

此外，还有一些在基因层面间接体现氨氧化古菌代谢活性的方法：(1)通常用定量PCR测定氨氧化古菌amoA基因绝对含量的方法表征生物活性，在对潜在微生物群落种类测定上可能会存在偏差，而且仅仅测定amoA基因的绝对含量，并不能完全代表其生物活性。(2)cDNA定量数据也是可以间接判断生物活性的方法，但cDNA定量的方法消耗的样品量非常多，一个样品需要几升的菌液，才可以完成测定，对原始培养样品中的生物生长影响很大；工作量大，实验成本高，耗时长：需要添加各种反应体系，很多次的样品处理以及几个小时的上机运行；处理过的样品不能再次利用，对细胞处于完全破坏状态。

发明内容

本发明的目的在于提供一种单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法，旨在解决现有技术中氨氧化古菌代谢活性检测方法耗时耗量、非原位检测对细胞破坏性强、精确度低的问题。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法，包括如下步骤：

提供N组含有同位素D₂O标记的培养基，且所述N组培养基中所述同位素D₂O的浓度各不相同，其中，N大于等于5；采用所述N组含有同位素D₂O标记的培养基分别对氨氧化古菌进行培养，培养至氨氧化古菌体中D原子达到饱和，收集氨氧化古菌细胞菌液；

将所述氨氧化古菌细胞菌液进行离心、洗涤，得到洗涤后的氨氧化古菌细胞菌液；

将所述洗涤后的氨氧化古菌细胞菌液滴加到载玻片上进行风干，选取一定量的细胞区域进行拉曼光谱的测定；