[发明专利]一种单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法

权利要求书

1.一种单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法，包括如下步骤：

提供N组含有同位素D₂O标记的培养基，且所述N组培养基中所述同位素D₂O的浓度各不相同，其中，N大于等于5；采用所述N组含有同位素D₂O标记的培养基分别对氨氧化古菌进行培养，培养至氨氧化古菌体中D原子达到饱和，收集氨氧化古菌细胞菌液；

将所述氨氧化古菌细胞菌液进行离心、洗涤，得到高浓度的洗涤后的氨氧化古菌细胞菌液；

将所述高浓度的洗涤后的氨氧化古菌细胞菌液滴加到载玻片上进行风干，选取一定量的细胞区域进行拉曼光谱的测定；

以2170cm^-1作为峰中心、260cm^-1作为宽度，计算不同浓度D₂O标记氨氧化古菌的拉曼光谱2040～2300cm^-1范围的C-D特征区域的积分光谱强度；以2950cm^-1作为峰中心、300cm^-1作为宽度，计算不同浓度D₂O标记氨氧化古菌的拉曼光谱2800～3100cm^-1范围的C-H特征区域的积分光谱强度，计算不同浓度D₂O标记氨氧化古菌的C-D特征区域的积分光谱强度占C-D特征区域和C-H特征区域的总积分光谱强度的百分比，标记为C-D％；根据N组培养基中所述同位素D₂O的浓度和计算获得的C-D％绘制标准曲线，获取回归方程；

提供含有同位素D₂O标记的培养基培养待测的氨氧化古菌样品，得到氨氧化古菌细胞菌液；将所述氨氧化古菌细胞菌液进行离心、洗涤，得到高浓度的洗涤后的氨氧化古菌细胞菌液，将所述高浓度的洗涤后的氨氧化古菌细胞菌液滴加到载玻片上进行风干，选取一定量的细胞区域进行拉曼光谱的测定；分析拉曼光谱2800～3100cm^-1范围的C-H特征区域的积分光谱强度，分析所述氨氧化古菌的代谢活性。

2.根据权利要求1所述的单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法，其特征在于，所述含有同位素D₂O标记的培养基中，以所述培养基的质量为100％，所述的同位素D₂O的质量百分含量为0～50％，且不为0。

3.根据权利要求1所述的单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法，其特征在于，所述采用所述N组含有同位素D₂O标记的培养基分别对氨氧化古菌进行培养的步骤中，所述培养的时间为15～18天，所述培养的温度为28～30℃。

4.根据权利要求1-3任一所述的单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法，其特征在于，所述提供的N组含有同位素D₂O标记的培养基中，每组采用三个平行样品进行测定。

5.根据权利要求1-3任一所述的单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法，其特征在于，在所述离心的步骤中，离心处理的转速为10000g～12000g，离心处理的时间为3～5min。

6.根据权利要求1-3任一所述的单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法，其特征在于，在所述洗涤的步骤中，采用超纯水进行洗涤处理。

7.根据权利要求6所述的单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法，其特征在于，所述采用超纯水进行洗涤处理的具体步骤如下：

将所述氨氧化古菌细胞菌液进行离心得到氨氧化古菌细胞菌体；

在所述氨氧化古菌细胞菌体中添加1～2mL超纯水，混匀得到第一混合物；

将所述第一混合物进行离心洗脱，得到第二混合物；

在所述第二混合物中加入5～40μL超纯水，吸打混匀得到所述洗涤后的氨氧化古菌细胞菌液。

8.根据权利要求1-3任一所述的单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法，其特征在于，所述洗涤步骤中，洗涤次数为3～5次。