[发明专利]一种保护aFGF蛋白药物稳定性和活性的方法

说明书

本发明属于药物技术领域，具体公开一种保护aFGF蛋白药物稳定性和活性的方法，步骤1、aFGF蛋白的表达；步骤2、aFGF蛋白的纯化；步骤3、脱盐；步骤4、aFGF蛋白浓度调整；步骤5、配制aFGF蛋白保护剂；步骤6、aFGF蛋白和保护剂混合；步骤7、分装，冷冻保存。本发明提供的保护aFGF蛋白药物稳定性和活性的方法，能显著提高aFGF蛋白的稳定性，并保护其生物活性。

技术领域

本发明属于生物药物技术领域，具体公开一种保护aFGF蛋白药物稳定性和活性的方法。

背景技术

酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor，aFGF)，是一种对来源于中胚层及神经外胚层的细胞，有广泛促分裂作用的微量活性物质，主要分布于脑、垂体、神经组织、视网膜、肾上腺、心脏和骨等器官或组织内，其他组织含量很少，在血清和体液中以极低的浓度存在。

aFGF具有广泛的生物学功能，能影响内分泌细胞、神经细胞及间充质细胞等多种细胞的生长、分化及其功能。由于aFGF具有促进损伤修复、营养和保护神经元、促血管生成等多方面的作用而成为目前研究的热点。

但aFGF稳定性较差，多项研究都显示重组aFGF蛋白(熔解温度40℃-50℃)的热稳定性远低于低bFGF(熔解温度55℃-60℃)，而且aFGF蛋白在体温环境下容易变性降解，对其在人体内作用的活性产生影响。

肝素是一种高度硫酸化的多糖，临床中主要用于抗凝血，能够保护aFGF蛋白，提高其稳定性和生物活性。但肝素多来源于猪肠粘膜，其价格相对较高，保护aFGF蛋白的作用也仅用于科学研究，对于实际应用不易推广。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供一种保护aFGF蛋白药物稳定性和活性的方法。

本发明提供的保护aFGF蛋白药物稳定性和活性的方法，具体包括以下步骤：

步骤1、aFGF蛋白的表达：将aFGF蛋白编码序列(UniProt编号：P05230，所选序列：16F-155D)插入含组氨酸标签的pET-11b质粒中后，导入到大肠杆菌BL21菌株中，当细菌密度生长至600nm吸光度为0.4-0.8时，在18℃环境下aFGF蛋白由IPTG诱导表达12-18h，离心收集细菌；

步骤2、aFGF蛋白的纯化：将步骤1中收集的细菌重悬在磷酸盐缓冲溶液中，并经超声裂解破碎将aFGF蛋白释放，细菌裂解液经肝素凝胶层析柱，使用洗脱液1洗脱得到aFGF蛋白粗品；aFGF蛋白粗品经镍离子凝胶层析柱分离，使用洗脱液2洗脱得到aFGF蛋白纯品液；

所述洗脱液1由三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液和NaCl配制而成，且所述三羟甲基氨基甲烷在所述洗脱液1中的质量浓度为50mmol/L，所述NaCl在所述洗脱液1中的质量浓度为1.5mol/L，所述洗脱液1的pH为7.2；

所述洗脱液2由三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液和咪唑配制而成，且所述三羟甲基氨基甲烷在所述洗脱液2中的质量浓度为50mmol/L，所述咪唑在所述洗脱液2中的质量浓度为0.3mol/L，所述洗脱液2的pH为7.2；

步骤3、脱盐：将步骤2中得到的aFGF蛋白纯品液装入透析袋中封闭，再将透析袋置于磷酸盐缓冲溶液中，4℃搅拌4小时后，更换PBS溶液，继续搅拌4小时，得到脱盐后的aFGF蛋白液；

步骤4、调整脱盐后的aFGF蛋白液的浓度；

步骤5、配制保护剂溶液；

所述保护剂溶液按体积分数计由50％甘油与50％混合溶液组成，所述混合溶液由磷酸盐缓冲液及硫酸葡聚糖组成，且所述硫酸葡聚糖在所述磷酸盐缓冲液中的浓度为经步骤4调整后的aFGF蛋白液浓度的1-10倍；

步骤6、将步骤4中脱盐后的aFGF蛋白液与步骤5中配制的硫酸葡聚糖溶液按体积比1:1-10混合，得到混合液；