[发明专利]抗生菜褪绿病毒的重组蛋白及其制备方法、多克隆抗体及制备方法、检测试剂盒及应用

说明书

本发明公开了一种抗生菜褪绿病毒的重组蛋白及其制备方法、多克隆抗体及制备方法、检测试剂盒及应用，抗生菜褪绿病毒的重组蛋白为LCV CPm重组蛋白，以LCV CPm基因为模板，通过PCR扩增得到扩增产物、酶切、连接、转化、分离得到。多克隆抗体由LCV CPm重组蛋白作为免疫原免疫大白兔得到。由多克隆抗体组成的检测试剂盒可应用于生菜褪绿病毒的血清学检测，该方法可以实现快速、高通量检测。

技术领域

本发明涉及植物病毒的血清学检测技术领域，尤其涉及抗生菜褪绿病毒的重组蛋白及其制备方法、多克隆抗体及制备方法、检测试剂盒及应用。

背景技术

生菜褪绿病毒(Lettuce chlorosis virus，LCV)属长线形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒属(Crinivirus)，由烟粉虱传播。该病毒最早报道能够侵染藜科作物甜菜和豆科作物绿豆，最近在我国的番茄上检测到该病毒，表明该病毒的寄主范围与其他Crinivirus属病毒一样较广。藜科作物甜菜和茄科作物番茄，经济附加值高，在我国种植范围广，是我国农业结构调整、农业提质增效中最重要的经济作物。LCV侵染甜菜，导致甜菜叶片黄化，块根变小；侵染番茄导致番茄叶片黄化、番茄果实出现褐色斑点。不但影响甜菜和番茄产量，更严重的是导致甜菜和番茄商品性丧失，严重影响这些经济作物的种植效益。

植物病毒病，目前生产上还缺乏有效的防控技术措施；预防是控制植物病毒病的最佳方法。建立高通量、快速的检测方法是预防植物病毒病最关键的技术之一。血清学方法具有这些优点，且广泛的应用于植物病毒的检测与病害诊断。由于侵染我国番茄的LCV不同地区分离物的核苷酸同源性高达99％，但与其他国家的，比如美国LCV分离物的核苷酸同源性仅为76％。因此，目前国外的研究成果无法应用于检测我国LCV分离物的快速血清学检测，需要寻求一种适用于国内的LCV的血清学检测方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种抗生菜褪绿病毒的重组蛋白及其制备方法、多克隆抗体及制备方法、检测试剂盒及应用，利用抗生菜褪绿病毒的重组蛋白作为抗原制备的LCV CPm蛋白多克隆抗体，利用间接ELISA和Dot-ELISA法进行检测样本中的生菜褪绿病毒，该方法可以实现快速、高通量检测。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种抗生菜褪绿病毒的重组蛋白，所述重组蛋白为LCV CPm重组蛋白，所述LCV CPm重组蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

做为一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述的重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以LCV CPm基因为模板设计引物对，对感染LCV植物的cDNA进行PCR扩增得到扩增产物；

(2)酶切所述扩增产物和载体，用连接酶连接得到重组载体；

(3)将所述重组载体转化至感受态细胞中得到转化产物；

(4)从所述转化产物分离出LCV CPm重组蛋白。

上述的制备方法，优选的，所述步骤(1)中所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物为SEQ ID NO.2所示的DNA序列；所述下游引物为SEQ ID NO.3所示的DNA序列。

上述的制备方法，优选的，所述步骤(2)中所述载体为pET-32α。

做为一个总的技术构思，本发明还提供了一种抗生菜褪绿病毒多克隆抗体，所述多克隆抗体以所述的LCV CPm重组蛋白作为免疫原免疫大白兔得到。

做为一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述的抗生菜褪绿病毒多克隆抗体的制备方法，所述制备方法为：将所述LCV CPm重组蛋白免疫大白兔获得多克隆抗体。

做为一个总的技术构思，本发明还提供了一种用于检测生菜褪绿病毒的检测试剂盒，包括所述的抗生菜褪绿病毒多克隆抗体。