[发明专利]抗生菜褪绿病毒的重组蛋白及其制备方法、多克隆抗体及制备方法、检测试剂盒及应用

权利要求书

1.一种抗生菜褪绿病毒的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白为LCV CPm重组蛋白，所述LCV CPm重组蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种权利要求1所述的重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以LCV CPm基因为模板设计引物对，对感染LCV植物的cDNA进行PCR扩增得到扩增产物；

(2)酶切载体和所述扩增产物，用连接酶连接得到重组载体；

(3)将所述重组载体转化至感受态细胞中得到转化产物；

(4)从所述转化产物分离出LCV CPm重组蛋白。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物为SEQ ID NO.2所示的DNA序列；所述下游引物为SEQ IDNO.3所示的DNA序列；

和/或，所述步骤(2)中所述载体为pET-32α。

4.一种抗生菜褪绿病毒多克隆抗体，其特征在于，所述多克隆抗体以权利要求1所述的LCV CPm重组蛋白作为免疫原免疫大白兔得到。

5.一种权利要求4所述的抗生菜褪绿病毒多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：将权利要求1所述的LCV CPm重组蛋白免疫大白兔获得多克隆抗体。

6.一种用于检测生菜褪绿病毒的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求4所述的抗生菜褪绿病毒多克隆抗体。

7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括PBST缓冲液、封闭液、辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗、第一显色液和显色终止液；

所述封闭液为含1％BSA的PBST缓冲液；所述第一显色液为3,3',5,5'-四甲基联苯胺；所述显色终止液为用无菌水配制的浓度为2M的硫酸溶液。

8.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括封闭液、碱性过氧化物酶标记羊抗兔二抗和第二显色液；

所述第二显色液包括0.1M的NaHCO₃、0.001M的MgCl₂、0.3g/L的四唑氮兰和0.15g/L的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐；所述封闭液为含1％BSA的PBST缓冲液。

9.一种权利要求7所述的检测试剂盒在制备检测生菜褪绿病毒的检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述应用为ID-ELISA检测，具体为：

S1-1、10×PBST缓冲液包被待测物，加入到酶标板中，用封闭液封闭；

S1-2、在酶标板中加入含有抗生菜褪绿病毒多克隆抗体的一抗溶液，进行孵育；

S1-3、在酶标板中加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗的溶液，进行孵育；

S1-4、加入第一显色液进行显色，用酶标仪检测OD450nm吸光值，OD 450nm吸光值≥2.5倍为阳性，反应孔OD 450nm吸光值＜2.5倍为阴性。

10.一种权利要求8所述的检测试剂盒在制备检测生菜褪绿病毒的检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述应用为Dot-ELISA检测，具体为：

S2-1、将待测物研磨后点到PVDF膜上，置于封闭液中温育；

S2-2、将PVDF膜置于含有抗生菜褪绿病毒多克隆抗体的一抗溶液中温育；

S2-3、将PVDF膜置于含碱性过氧化物酶标记羊抗兔二抗的溶液中温育；

S2-4、将PVDF膜置于第二显色液中显色，若感染生菜褪绿病毒，则显示深蓝色或蓝紫色；若没有感染生菜褪绿病毒，则显示浅绿色或无色。