[发明专利]一种用于miRNA的高通量测序文库制备方法

说明书

由于目前缺乏一种专门精确定量常规样品中miRNA的高通量测序文库制备方法，故本发明提出一种精确定量化的针对miRNA的高通量测序文库制备方法，其主要包括如下步骤：取一定量RNA样品与衔接子RA3混合进行连接反应，再与衔接子RA5进行连接反应，接着与特异性结合于衔接子RA3的反转录引物RT Primer混合，进行反转录反应，得到DNA第一链；然后与特异性结合于衔接子RA3相应区域的通用引物RNA primer1和特异性结合于衔接子RA5相应区域的特异引物RNA primer index混合，进行PCR反应，获得扩增产物；最后将扩增产物进行6％凝胶电泳，割取所需的目的DNA片段并回收，此即制备完成的测序文库，经长度范围检测和浓度定量之后即可用于Illunima高通量测序平台直接测序。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种用于miRNA(英文全称为microRNA，中文名称为微小RNA)的高通量测序文库的制备方法。

背景技术

miRNA是一类内生的、长度约为22个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。目前针对miRNA的序列组成和功能研究渐成热点，市场上主流的用于miRNA高通量文库制备试剂盒诸如Illumina公司的TruSeqSmall RNA文库制备试剂盒，NEB针对Illumina测序平台研发的Small RNA建库试剂盒(NEB Multiplex Small RNA LibraryPrep Set for Illumina)等。这些商用试剂盒都是针对miRNA进行建库的，实验流程大体类似，但构建的测序文库都没有精准定量，难以满足精确定量分析的需求。已有Saiful Islam等报道针对单细胞测序时采用的定量化标签(unique molecular identifiers，UMI)方法(Nature Methods,11(2),2014:163-166)，但不能直接用于常规样品中各类RNA的建库和定量分析。目前尚无报道针对常规样品的RNA尤其是miRNA的完全定量化的文库制备技术，因此无法满足精准医学和定量生物学的实际需要。综上所述，本领域尚缺乏一种专门针对常规样品中miRNA的精确定量需求的高通量测序文库制备方法。

发明内容

在上海交通大学邵志峰教授的帮助下，本发明提供了一种精确定量化的针对miRNA的高通量测序文库制备方法。

一种用于miRNA的高通量测序文库制备方法，其包括如下步骤：

(1)提供一用于制备测序文库的常规RNA样品，来源不限，总体积为5μl，总量为10ng～1μg；

(2)提供一用于连接步骤(1)中所述的RNA样品3’端的衔接子RA3，RA3的序列为TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG；

(3)提供一用于连接步骤(1)中所述RNA样品5’端的衔接子RA5，衔接子RA5的序列包括固有结构S1-S2-S3，其中S1的碱基序列为GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC，S2是长度为10～15个的简并碱基N_10-15，S3是长度为4个的固定碱基，且S3选自ACGA、CCGA、CGAT、CGTA、CGTT、GACG、GCCA、GCGT、GGAA、GTCG、GTCT中的一种；

(4)取一定量步骤(1)所述的RNA样品与适量步骤(2)所述的衔接子RA3混合进行连接反应，从而形成核酸-衔接子RA3的复合物；

(5)将步骤(4)中获得的核酸-衔接子RA3的复合物与衔接子RA5进行连接反应，从而形成衔接子RA5-核酸-衔接子RA3的复合物；

(6)将步骤(5)获得的衔接子RA5-核酸-衔接子RA3的复合物与特异性结合于衔接子RA3的反转录引物RT Primer混合，进行反转录反应，得到DNA第一链；