[发明专利]一种用于miRNA的高通量测序文库制备方法

权利要求书

1.一种用于miRNA的高通量测序文库制备方法，其特征在于：其包括如下步骤：

(1)提供一用于制备测序文库的常规RNA样品，来源不限，总体积为5μl，总量为10ng～1μg；

(2)提供一用于连接步骤(1)中所述的RNA样品3’端的衔接子RA3，RA3的序列为TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG；

(3)提供一用于连接步骤(1)中所述RNA样品5’端的衔接子RA5，衔接子RA5的序列包括固有结构S1-S2-S3，其中S1的碱基序列为GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC，S2是长度为10～15个的简并碱基N_10-15，S3是长度为4个的固定碱基，且S3选自ACGA、CCGA、CGAT、CGTA、CGTT、GACG、GCCA、GCGT、GGAA、GTCG、GTCT中的一种；

(4)取一定量步骤(1)所述的RNA样品与适量步骤(2)所述的衔接子RA3混合进行连接反应，从而形成核酸-衔接子RA3的复合物；

(5)将步骤(4)中获得的核酸-衔接子RA3的复合物与衔接子RA5进行连接反应，从而形成衔接子RA5-核酸-衔接子RA3的复合物；

(6)将步骤(5)获得的衔接子RA5-核酸-衔接子RA3的复合物与特异性结合于衔接子RA3的反转录引物RT Primer混合，进行反转录反应，得到DNA第一链；

(7)将步骤(6)获得的DNA第一链与特异性结合于衔接子RA3相应区域的通用引物RNAprimer1和特异性结合于衔接子RA5相应区域的特异引物RNA primer index混合，进行PCR反应，获得扩增产物；

(8)将步骤(6)获得的扩增产物进行6％聚丙烯酰胺凝胶电泳，胶块经染色后在紫外灯下识别各DNA条带，割取所需的目的DNA片段并回收，此即制备完成的测序文库，经长度范围检测和浓度定量之后即可用于Illunima高通量测序平台直接测序。

2.如权利要求1所述的用于miRNA的高通量测序文库制备方法，其特征在于：所述的常规RNA样品是指从各种来源，包括但不限于使用各类提取方法从各类动植物细胞中获得的总量在10ng～1μg的总RNA，且纯度和质量符合一般RNA要求，不含DNA、蛋白质等其他杂质。

3.如权利要求1所述的用于miRNA的高通量测序文库制备方法，其特征在于：所述的目的DNA片段的长度为miRNA的长度+测序接头的长度+S2的长度+S3的长度，其中，miRNA的长度为15～30bp，测序接头的长度为125bp，S2的长度为10～15bp，S3的长度为4bp。

4.如权利要求1所述的用于miRNA的高通量测序文库制备方法，其特征在于：所述的目的DNA片段的长度为22bp+125bp+S2+4bp±10bp。

5.采用权利要求1的方法制备出来的测序文库。

6.如权利要求5所述的测序文库，其特征在于：测序读长在50bp到150bp之间，测序模式为单端测序或双端测序。

7.应用权利要求1的方法制备出来的测序文库的分析方法，其特征在于：还包括对数据进行PCR重复序列的去除。