[发明专利]苜蓿镰孢菌根腐病病原毒素化学型的检测引物及检测方法

说明书

本发明涉及植物检验检疫技术领域，具体涉及苜蓿镰孢菌根腐病病原毒素化学型的检测引物及检测方法。本发明提供用于检测苜蓿镰孢菌根腐病病原毒素化学型的特异性引物，其序列如SEQ ID NO.1～6所示。利用这三对特异性引物能够准确、快速、便捷地检测苜蓿镰孢菌根腐病病原是否具有产生单端孢霉烯族毒素、玉米赤霉烯酮和伏马菌素的潜力，进而实现了利用常规PCR技术进行苜蓿镰孢菌根腐病病原毒素化学型的准确、特异、灵敏的检测，有效节省了检测时间和成本，为对从苜蓿或苜蓿制品上分离的镰孢菌的产毒素潜力评估提供了简单、快速、准确的方法。

技术领域

本发明涉及植物检验检疫技术领域，具体涉及用于检测苜蓿镰孢菌根腐病病原毒素化学型的特异性引物及利用该特异性引物检测苜蓿镰孢菌根腐病病原毒素化学型的方法。

背景技术

苜蓿(Medicago sativa)是世界上种植面积最大的豆科牧草，被誉为“牧草之王”，具有重要的经济价值和生态价值。近年来，中国苜蓿种植面积逐步增加。随着苜蓿种植面积和种植年限的增加，苜蓿根腐病日益严重。苜蓿根腐病可在苜蓿各个生育时期发生，其症状多表现为植物组织的萎蔫下垂，严重时整株枯黄，容易从土壤中拔出，苜蓿根腐病植物的根系与正常根系相比，呈现严重萎缩。苜蓿根腐病一旦大面积流行会严重降低苜蓿产量和品质，甚至需要重新建植。

镰孢菌是造成苜蓿根腐病的主要病原之一，镰孢菌可产生单端孢霉烯族毒素、玉米赤霉烯酮、伏马菌素等毒素，其产生的毒素是导致病害的原因之一，同时会对人畜神经系统、消化系统、生殖系统等造成危害，可导致人畜急性中毒，给人畜健康造成严重危害。不同镰孢菌可产生的毒素类型会有所差异，从而可将镰孢菌划分为不同的毒素化学型。进行镰孢菌毒素化学型的检测，对于了解镰孢菌的产毒素潜力，进一步了解镰孢菌致病机制和提早采取防范措施以防止对人畜健康造成危害具有重要意义。

目前，镰孢菌毒素化学型的检测包括薄层层析法(thin layer chromatography,TLC)、酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)、核磁共振波谱法(nuclearmagnetic resonance spectroscopy,NMR)等方法。TLC方法操作简单、成本低，但对人体有危害，通常情况下只能用于定性检测，并且无法同时检测大量样品；ELISA检测时不需要经过前处理，特异性高，灵敏性强，可快速检测大量样品，所需设备简单，易于推广，但该方法存在假阳性、检测对象单一、需要抗体的制备及保存等弊端；NMR方法具有高效准确、可定量、无需前处理便可以检测到目标化合物等优点，但其分辨率相对较低，仪器较为昂贵；HPLC具有灵敏度高、快速准确、适合微量样品检测等优点，并且可与质谱联用，实现定量检测，是目前应用较多的一种检测方法，但是该方法主要是利用高效液相色谱仪、质谱仪、液相-质谱联用仪等大型实验室才配备的仪器，这些仪器不仅价格昂贵，而且对人员的操作有较高要求，还涉及到毒素的发酵、提纯和样品的前处理等复杂过程。因此，亟需开发一种依靠实验室常规仪器、操作简单便捷、检测速度快、灵敏度高的方法。

近年来，镰孢菌毒素产生相关途径和调控机制方面的研究进展迅速，基于相关产毒素基因的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)检测方法逐渐用于镰孢菌毒素化学型的检测。利用PCR技术检测产毒素基因相对来说，只需要用到PCR仪和电泳仪等实验室常见的仪器，检测速度快，操作相对简单。

以往关于镰孢菌产毒素类型分析的研究大多集中在引起谷物病害的镰孢菌，对于引起苜蓿根腐病的镰孢菌毒素化学型的研究极少，并且由于镰孢菌在种的分类单元下可划分为不同的专化型、变种等，从而导致不同镰孢菌产毒素类型的复杂化。因此，开发准确灵敏的用于苜蓿镰孢菌根腐病病原毒素化学型鉴定的PCR检测方法对于镰孢菌的产毒素潜力分析以及苜蓿根腐病的防控具有重要意义。

发明内容