[发明专利]苜蓿镰孢菌根腐病病原毒素化学型的检测引物及检测方法

权利要求书

1.用于检测苜蓿镰孢菌根腐病病原毒素化学型的特异性引物，其特征在于，包括：

SEQ ID NO.1：Tri5H1-F：AGTTGGGCCAAGGTTTCCAA；

SEQ ID NO.2：Tri5H1-R：AAGGAACTGCTTGCGCTCAT；

SEQ ID NO.3：ZEA13H1-F：AGTTGGAATACCCCGCTTGG；

SEQ ID NO.4：ZEA13H1-R：CCACGATCCAAGACCGTTGA；

SEQ ID NO.5：FUM8H1-F：TTGCATAGGGGTTGGTGCAA；

SEQ ID NO.6：FUM8H1-R：GGAACAATCCAGCAAGCGTC。

2.包含权利要求1所述的用于检测苜蓿镰孢菌根腐病病原毒素化学型的特异性引物的试剂盒。

3.权利要求1所述特异性引物或权利要求2所述试剂盒在检测苜蓿镰孢菌根腐病病原毒素化学型中的应用。

4.权利要求1所述特异性引物或权利要求2所述试剂盒在检测苜蓿镰孢菌产毒素潜力中的应用。

5.权利要求1所述特异性引物或权利要求2所述试剂盒在苜蓿病原菌检验检疫或苜蓿镰孢菌根腐病防控中的应用。

6.一种苜蓿镰孢菌根腐病病原毒素化学型的检测方法，其特征在于，利用权利要求1所述的特异性引物或权利要求2所述的试剂盒进行检测。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）提取待测苜蓿镰孢菌根腐病病原的基因组DNA；

（2）以所述基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的特异性引物或权利要求2所述的试剂盒进行PCR扩增；

（3）根据PCR扩增产物判断苜蓿镰孢菌根腐病病原所含毒素基因的类型，确定苜蓿镰孢菌根腐病病原毒素化学型。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃预变性2~5 min；94℃变性20~30 s，52~54℃退火30 s，72℃延伸30 ~60 s，30~35个循环；72℃延伸10 min。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，当采用Tri5H1-F/Tri5H1-R引物对时，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃预变性2 min；94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸40 s，35个循环；72℃延伸10 min；

当采用ZEA13H1-F/ZEA13H1-R引物对时，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃预变性2min；94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸10 min；

当采用FUM8H1-F/FUM8H1-R引物对时，所述PCR扩增的反应程序包括：94℃预变性5min；94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min。

10.根据权利要求7~9任一项所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的25 μL反应体系如下：10 μmol/L上下游引物各1 μL，2×PCR反应预混液12.5 μL，100 ng/μL 基因组DNA 1 μL，补ddH₂O至25 μL。

11.根据权利要求7~9任一项所述的检测方法，其特征在于，所述根据PCR扩增产物判断苜蓿镰孢菌根腐病病原所含毒素基因的类型为根据电泳条带的有无及大小判断苜蓿镰孢菌根腐病病原是否含有单端孢霉烯族毒素Tri5基因、玉米赤霉烯酮Pks13基因、伏马菌素Fum8基因。

12.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于，所述根据PCR扩增产物判断苜蓿镰孢菌根腐病病原所含毒素基因的类型为根据电泳条带的有无及大小判断苜蓿镰孢菌根腐病病原是否含有单端孢霉烯族毒素Tri5基因、玉米赤霉烯酮Pks13基因、伏马菌素Fum8基因。