[发明专利]无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗的制备方法

说明书

本发明提供了一种无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗的制备方法，包括以下步骤：A.采用第一无血清培养基a，建立无血清Vero细胞主细胞库和工作细胞库；B.采用第二无血清培养基b，建立无血清人用狂犬病疫苗毒株工作种子批；C.将步骤A的Vero工作细胞库的细胞复苏、传代扩增后接种生物反应器，采用第三无血清培养基c1，载体灌流培养；接种步骤B的毒株工作种子批，采用第四无血清培养基c2，培养病毒；收获病毒液，经超滤浓缩、病毒液灭活、纯化、半成品配制后分装冻干，得到无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗。本发明采用无血清培养替代现有有血清培养工艺、重组人血白蛋白替代现有人血白蛋白工艺，保证了生物制品安全性。

技术领域

本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及一种无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗的制备方法。

背景技术

狂犬病是由狂犬病毒引起的人兽共患疾病，人和所有的温血动物对狂犬病病毒都易感。一旦发病100％死亡，唯一有效的方法是接种有效的人用狂犬病疫苗。Vero细胞由于它的生长快速、易于规模化培养、生产成本低等特点，已应用于多种人用疫苗的生产，如乙脑疫苗、手足口疫苗、灭活脊髓灰质炎疫苗、轮状疫苗、狂犬病疫苗等等。

目前国内上市销售的狂犬病疫苗生产工艺，在细胞培养阶段无论是Vero细胞还是二倍体细胞，均需要添加一定比例的牛血清，在病毒培养阶段或添加低含量的牛血清，或添加一定比例的人血白蛋白，由于狂犬病病毒易聚集和不稳定的特点，在纯化后的原液及半成品中需要添加保护剂，几乎都使用人血白蛋白作为保护剂。

利用牛血清作为细胞培养和疫苗制备的培养基补充成分，具有诸多不利因素：(1)血清的批间差异及质控：每批血清都不同，更换血清时需要做大量的测试以确保替换的血清与前一批血清最为相似；(2)污染：血清经常被病毒污染，目前血清灭菌技术能够避免正规厂家提供的血清感染支原体的可能，但病毒感染仍然是个问题；(3)价格：血清是培养基中最贵的成分，但如果用指定的成分来替换血清，那么这些成分的总价格与血清相当，但随着转铁蛋白、硒、胰岛素等市场需求的不断增加，这些物质的价格在降低，无血清培养基也会更便宜。(4)生长抑制剂：血清不仅对细胞生长起促进作用，而且也起抑制作用。因此，无血清培养已成为包括疫苗在内的生物技术药物生产的总趋势。

人血白蛋白(HSA)是存在于人循环系统中的最普遍的血液蛋白，由585个氨基酸组成，是人用生物制品很好的蛋白保护剂，但由于血液中存在各种传染性疾病病原体的潜在危险，尤其是艾滋病、乙肝等病毒的传播，来自人源血浆的白蛋白在纯化过程中难免将这些病毒带入终产品。

发明专利(公开号CN106834239A和CN107760647A)均阐述了使用无血清Vero细胞制备狂犬病疫苗原液的方法，但仍然使用人血白蛋白为疫苗保护剂，同时上述两个专利申请的工艺仍存在不足。本发明通过大量实验摸索出无血清培养替代现有有血清培养工艺、重组人血白蛋白替代现有人血白蛋白工艺，且制备出的疫苗产品质量标准与原工艺相当，生产成本合理，可实现无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗的商业化生产。

本发明提供的无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗的制备方法属于首次。

发明内容

为解决狂犬病疫苗生产过程中大量的使用牛血清和人血白蛋白的问题，本发明提供一种无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗的制备方法，为狂犬病疫苗的安全制备开拓了新领域。

本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗的制备方法，包括以下步骤：

A.采用第一无血清培养基a，进行Vero细胞的复苏、传代和冻存，建立无血清Vero细胞主细胞库和工作细胞库；

B.将步骤A建立的无血清Vero细胞工作细胞库的冻存无血清Vero细胞进行复苏、传代扩增，然后接种人用狂犬病疫苗毒株，采用第二无血清培养基b培养扩增至病毒高峰，收获病毒液冻存，建立无血清人用狂犬病疫苗毒株工作种子批；