[发明专利]无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗的制备方法

权利要求书

1.一种无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

A.采用第一无血清培养基a，进行Vero细胞的复苏、传代和冻存，建立无血清Vero细胞主细胞库和工作细胞库；

B.将步骤A建立的无血清Vero细胞工作细胞库的冻存无血清Vero细胞进行复苏、传代扩增，然后接种人用狂犬病疫苗毒株，采用第二无血清培养基b培养扩增至病毒高峰，收获病毒液冻存，建立无血清人用狂犬病疫苗毒株工作种子批；

C.将步骤A建立的无血清Vero细胞工作细胞库的冻存无血清Vero细胞复苏、传代扩增后接种至生物反应器，采用第三无血清培养基c1，载体灌流培养细胞；在细胞的数量达高峰时，接种步骤B的无血清人用狂犬病疫苗毒株工作种子批，采用第四无血清培养基c2，培养病毒；然后收获病毒液，经超滤浓缩、病毒液灭活和水解、纯化、半成品配制后分装冻干，得到所述无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗；

其中，在步骤A中，所述第一无血清培养基a为含5～7g/L Sheff-VAX Plus ACF的VP-SFM；在步骤B中，所述第二无血清培养基b为含8～10g/L Sheff-VAX Plus PF ACF VP的VP-SFM；在步骤C中，所述第三无血清培养基c1为含9～15g/L Sheff-VAX Plus ACF的VP-SFM，所述第四无血清培养基c2为含6～8g/L Sheff-VAX Plus PF ACF VP的VP-SFM。

2.如权利要求1所述的无动物源性和人源性成分的狂犬病疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤C具体步骤为：

1)无血清Vero细胞复苏及传代

将步骤A建立的无血清Vero细胞工作细胞库的冻存无血清Vero细胞复苏、传代扩增至细胞密度2～4×10⁶个/ml；

2)生物反应器片状载体细胞培养

将上述步骤1)复苏传代至细胞密度2～4×10⁶个/ml的无血清Vero细胞转入到细胞接种瓶中，无菌连接细胞接种瓶和生物反应器，使用正压将细胞接种到生物反应器内；补充所述第三无血清培养基c1至工作体积；调整生物反应器培养参数，温度37±0.5℃，pH7.2±0.1，溶氧50％，搅拌速度30～50转/分钟；细胞接种24小时后，调整搅拌桨转速50～90转/分钟，开始灌流培养细胞；结合每日监测的葡萄糖含量调整灌流量，使葡萄糖含量保持大于1.0g/L；当第6-7天细胞数量达高峰时，准备接种病毒；

3)病毒扩增及病毒液收获

(1)病毒接种

根据葡萄糖消耗量计算上述步骤2)Vero细胞数量达高峰时的细胞数，按MOI0.01-0.05加入步骤B的无血清人用狂犬病疫苗毒株工作种子批毒种，和所述第四无血清培养基c2，以20～30转/分钟进行片状载体上细胞与病毒的吸附，吸附时间为30-60分钟，吸附温度为33-35℃；吸附完成后，将转速调至50～90转/分钟；

(2)病毒培养及收获

完成细胞对病毒的吸附之后，转速提至50-90转/分钟，温度34～35℃，72h之后，用所述第四无血清培养基c2进行连续灌流并开始收获病毒液，连续收获7-10天病毒液之后，停止收获；

4)病毒液超滤浓缩

将上述步骤3)得到的病毒收获液以0.8+0.65μm进行预过滤，以除去细胞碎片，然后用300KD-1000KD膜包，浓缩15-40倍，得到病毒浓缩液；

5)灭活、水解

上述步骤4)得到的病毒浓缩液置2～8℃预冷18小时以上，每1000ml病毒浓缩液按终浓度1/4000，加10％稀释的β-丙内酯2.5ml，充分摇匀，置2～8℃24小时后置37℃水解2小时；

6)纯化

灭活后的病毒液经index-20Sepharose 4FF琼脂糖凝胶柱层析进行纯化；上样量为层析柱体积的5～10％，当紫外监测数值达到0.02Au以上时，收集第一目的峰，按照质量体积终浓度1％加入重组人血白蛋白，得到疫苗原液；检测疫苗原液的蛋白质含量和抗原含量；

7)半成品配制

根据上述步骤6)检测的疫苗原液蛋白质含量和抗原含量，将疫苗原液与稀释液PBS进行1:4～1:8体积比混合并除菌，加入冻干保护剂，配制成半成品；

8)成品

将上述步骤7)得到的半成品进行分装冻干，即得到成品。