[发明专利]幽门螺杆菌阴阳性与克拉霉素耐药性同步检测法

说明书

本发明公开一种幽门螺杆菌阴阳性与克拉霉素耐药性同步检测法，其包括(1)向样品中加入第一溶液、于80‑100℃下处理2‑10分钟后，进行第一离心得到第一上清液，其中第一溶液包含1‑10重量％的十二烷基硫酸钠，且pH为5.4‑5.6；(2)向第一上清液中加入抑制剂清除剂混合均匀后，进行第二离心得到第二上清液；(3)向第二上清液中依次加入蛋白酶K和第二溶液并于60‑80℃下孵育5‑20分钟，然后加入无水乙醇混匀得到提取液，其中第二溶液包含30‑50重量％盐酸胍和0.1‑1重量％马来酸，且pH为5.8‑6.2；(4)使用离心柱从提取液中纯化得到核酸；(5)检测核酸中的野生型菌含量和突变型菌含量，由此判断样品中幽门螺旋杆菌的阴阳性以及在阳性情况下幽门螺旋杆菌的克拉霉素耐药性。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种无创高灵敏同时检测幽门螺旋杆菌有无及其克拉霉素耐药性的方法。

背景技术

幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，简称H pylori或者Hp)是革兰氏阴性、微需氧的细菌，生存于胃部及十二指肠的各区域内。在人群中具有较高的感染率。随着幽门螺旋杆菌在人群中传播广泛，以及抗生素的广泛应用，Hpylori耐药菌株的发生率逐年上升，根除的难度逐渐增加。最近报道H pylori耐药是全球性的，其耐药是导致根除治疗失败的主要原因。对H pylori根除治疗的常用抗生素有克拉霉素、甲硝唑、阿莫西林、四环素及喹诺酮类等，大多数H pylori菌株对这些抗生素的耐药是由突变引起的，包括自发突变和通过耐药信息的传递引起的突变等。根据中华医学会消化病学会Hp学组2005年对全国16个省市340例Hp耐药情况进行的多中心研究表明，对克拉霉素的耐药率为27.6％，H pylori对抗生素耐药的检测目前已经不再局限于传统的药物敏感性试验，由传统的细菌培养、药物敏感试验逐渐转向分子生物学检测方法。耐药基因突变的检测若能成为H pylori检查的常规项目，无论从患者的医药费开支还是药物对患者引起的不良反应方面，均有重要意义。

目前临床检测幽门螺旋杆菌主要包括Hp培养，尿素酶实验，Hp糖体ELESA检测和免疫印迹检测法。培养的方法需要1-2周时间，免疫方法不能直接检测菌体，且不能检测是否耐药。幽门螺旋杆菌耐药的检测主要是通过细菌培养进行检测以及基于聚合酶链式反应为基础的分子生物学技术。但是这些方法多依赖于创伤取样，对受检者会造成一定损伤。Hp可从胃经过消化道而随粪便排泄出来，直接检测粪便中HP，难以产生假阴性。因此，粪便已成为公认的检测HP的材料。利用粪便检测HP是一种无创检测手段，病人容易接受。然而，粪便中Hp含量毕竟要低于的胃粘膜组织、胃液中，并且粪便中含有大量复杂成分，很难灵敏地检测。

发明内容

为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供一种幽门螺杆菌阴阳性与克拉霉素耐药性同步检测法，其包括：

(1)向样品中加入第一溶液在80-100℃下处理2-10分钟后，进行第一离心得到第一上清液，其中所述第一溶液包含1-10重量％的十二烷基硫酸钠，且pH为5.4-5.6。本发明中第一溶液用于裂解细菌细胞。在加入前，优选预热第一溶液至80-100℃，例如85℃，从而避免可能的析出和沉淀。

(2)向所述第一上清液中加入抑制剂清除剂混合均匀后，进行第二离心得到第二上清液。在粪便等复杂样品中存在大量抑制因子，常规的核酸纯化方式并不能有效地去此类大量抑制因子而导致后续检测失败。因此，需要在该步骤中加入抑制剂清除剂，以高效地回收复杂样品中的核酸物质。抑制剂清除剂可优选使用PCR抑制剂吸收基质，例如InhibitEX-100。

(3)向所述第二上清液中依次加入蛋白酶K和第二溶液并于60-80℃下孵育5-20分钟，然后加入无水乙醇混匀得到提取液，其中所述第二溶液包含30-50重量％盐酸胍和0.1-1重量％马来酸，且pH为5.8-6.2。优选地，蛋白酶K以溶液形式加入，其加入量不特别限定，例如可为10-50μl。蛋白酶K的加入有利于除蛋白和杂质。第二溶液用于进一步裂解细胞。