[发明专利]幽门螺杆菌阴阳性与克拉霉素耐药性同步检测法

权利要求书

1.一种幽门螺杆菌阴阳性与克拉霉素耐药性同步检测法，其特征在于，包括：

(1)向样品中加入第一溶液在80-100℃下处理2-10分钟后，进行第一离心得到第一上清液，其中所述第一溶液包含1-10重量％的十二烷基硫酸钠，且pH为5.4-5.6；

(2)向所述第一上清液中加入抑制剂清除剂混合均匀后，进行第二离心得到第二上清液；

(3)向所述第二上清液中依次加入蛋白酶K和第二溶液并于60-80℃下孵育5-20分钟，然后加入无水乙醇混匀得到提取液，其中所述第二溶液包含30-50重量％盐酸胍和0.1-1重量％马来酸，且pH为5.8-6.2；

(4)使用离心柱从所述提取液中纯化得到核酸；

(5)检测核酸中的野生型菌含量和突变型菌含量，由此判断样品中幽门螺旋杆菌的阴阳性以及在阳性情况下幽门螺旋杆菌的克拉霉素耐药性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)包括检测幽门螺旋杆菌的23SrRNA和16S rRNA。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，检测幽门螺旋杆菌23S rRNA的步骤包括检测23S rRNA第2142和2143位点突变的步骤。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(5)中：

当所述野生型菌含量大于2，且所述突变型菌含量大于2时，判定所述样品为幽门螺旋杆菌阳性，且该幽门螺旋杆菌包含耐克拉霉素突变株；

当所述野生型菌含量大于2，且所述突变型菌含量为2以下时，判定所述样品为幽门螺旋杆菌阳性，且该幽门螺旋杆菌不包含耐克拉霉素突变株；

当所述野生型菌含量为2以下，且所述突变型菌含量大于2时，判定所述样品为幽门螺旋杆菌阳性，且该幽门螺旋杆菌全部为耐克拉霉素突变株；

当所述野生型菌含量为2以下，且所述突变型菌含量为2以下时，判定所述样品为幽门螺旋杆菌阴性。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述野生型菌含量(拷贝/微克粪便总DNA)的计算公式为：((VIC(每微升样品拷贝数)-VIC(每微升对照水拷贝数))×15)/(DNA(样品，μg/μl)×5)；

突变型菌含量(拷贝/微克粪便DNA)的计算公式为：((FAM(样品)-FAM(水))×15)/(DNA(样品，μg/μl)×5)。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品为粪便。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，采用基于芯片法的数字PCR进行步骤(5)中的核酸检测。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述基于芯片法的数字PCR的反应体系包含2×PCR母液混合物7.5μl、P+P液(23 S RNA引物及23S RNA 4种探针所配溶液)1.46μl、待检核酸5μl。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述基于芯片法的数字PCR的程序如下：

第一步：96℃ 10分钟，一次；

第二步：57℃2分钟+98℃30秒，重复44次；

第三步：57℃3分钟，一次。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸的浓度大于100ng/μl。