[发明专利]一种利用三种糖基转移酶制备Globotriose-连接的活性糖肽的方法

说明书

本发明公开了一种利用三种糖基转移酶分步合成法制备含有Globotriose‑连接活性糖肽的方法，首先是利用N‑糖基转移酶ApNGT将UDP‑Glc转移至含有N‑X(X≠P)‑T/S糖基化位点的多肽上的Asn氨基酸残基上，随后在β‑1,4‑半乳糖基转移酶LgtB的作用下合成Peptide‑Lactose，然后在α‑1,4‑半乳糖基转移酶LgtC的作用下合成产物，再使用高压液相色谱进行纯化，洗脱样品浓缩，产物冷冻干燥后即获得具有生物活性的Peptide‑globotriose活性糖肽。本发明方法为大量快速的生产多种基于Globotriose的寡糖肽提供了可能，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种活性糖肽的制备方法，尤其涉及一种利用三种糖基转移酶分步合成法制备含有Globotriose-连接活性糖肽的方法，属于生物技术领域。

背景技术

Globotriose(α-Gal(1→4)β-Gal(1→4)β-Glc，Gb3)是中性糖鞘脂globotrio-神经酰胺(globotriaosylceramide，Gb3-cer)的碳水化合物部分，参与许多重要的生理学过程。Gb3位于细胞膜上，在细胞的生长、分化以及癌症转移等方面有着重要的作用。有研究表明Gb3在乳腺癌和淋巴瘤等中过量表达，可以作为一种有效分子标记应用于肿瘤发展过程中。另外，globotriose还是一些肿瘤相关糖抗原如GloboH和SSEA4糖链的核心结构，而这些糖抗原与人类的肺癌、脑癌的产生与发展存在着千丝万缕的联系，因此globotriose可在癌症疫苗的开发研究过程中扮演相关肿瘤糖抗原的合成前体进行应用。同时病原菌O157:H7的志贺氏毒素(Stx)也是通过与肠道细胞表面的Globotriose结合引起痢疾甚至致命性综合尿毒症(HUS)，这使得Globotriose可以被用来抵抗志贺氏毒素Stx感染。近年还有文献证实Globotriose在细胞表面的表达量与机体对HIV-1的抵抗性呈现相关性。过去Globotriose大部分是以寡糖的形式进行利用，但是将寡糖链与多肽相连接形成糖肽后，多肽可以作为一种特殊的骨架以辅助改善寡糖链的生物相容性、提高对一些水解酶的抗性等，明显提升了Globotriose的作用。因此活性糖肽的合成制备及重要生物学功能的研究具有广泛意义。

糖肽合成技术的发展可以有效地帮助科学家解决在探索糖蛋白科学领域时遇到的棘手问题。最早的活性糖肽制备使用化学法进行合成，存在产率低、副产物积累较多等缺点。目前使用酶法合成糖肽因其步骤简便、且酶催化合成的糖肽键具有良好的立体及区域选择性而被广泛关注和应用。然而，初期使用的空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)的N-糖基化系统(Pgl)在大肠杆菌中合成糖缀合物，还是产率非常低，无法满足科研和生产需求。近期检索发现，有关利用多种糖基转移酶分步合成法制备含有Globotriose-连接活性糖肽的方法还未见报道。

发明内容

针对现有活性糖肽合成方法产率低、副产物多等不足，本发明要解决的问题是提供一种利用三种糖基转移酶分步合成法制备含有Globotriose-连接活性糖肽的方法。

本发明所述的利用三种糖基转移酶分步合成法制备含有Globotriose-连接活性糖肽的方法，步骤是：

(1)以含有N-X(X≠P)-T/S的N-糖基化位点的多肽为起始底物，利用N-糖基转移酶ApNGT合成Peptide-Glc活性糖肽；

(2)以获得的Peptide-Glc活性糖肽，利用β-1,4-半乳糖基转移酶LgtB合成Peptide-Glc-Gal活性糖肽；

(3)以获得的Peptide-Glc-Gal活性糖肽，利用α-1,4-半乳糖基转移酶LgtC合成制得Peptide-globotriose活性糖肽。